2. 清华大学 生物医学工程系, 北京 100084;
3. 深圳信息职业技术学院 电子与通信学院, 深圳 518172
2. Department of Biomedical Engineering, Tsinghua University, Beijing 100084, China;
3. Electronics and Communication College, Shenzhen Institute of Information Technology, Shenzhen 518172, China
以电刺激为基础的人工耳蜗,已经帮助全球超过12万听力重度和极重度受损者恢复部分听觉[1]。由于电刺激的参数能够被量化控制,并且可以根据具体需要设计不同的刺激电极[2],因此,电刺激法广泛应用于神经刺激的各个领域。尤其是近二十多年来,随着生物医学、材料学和电子科学等领域的蓬勃发展,人工耳蜗技术不断完善,目前主要是在优化植入系统的设计、鉴定最好的蜗内电极阵列和刺激模式、精练已成型的处理策略、对内部和外部器件进行小型化等方面不断改进[3]。
相比于电流,激光拥有许多吸引人的特性。理论上,激光良好的方向性可以允许在耳蜗内植入较多的光纤,显著提高人工耳蜗的频率分辨率。此外,用激光刺激耳蜗内的听神经,具有刺激源和组织不直接接触、不产生刺激伪迹等优点,因此激光是理想的刺激源[4]。近年来,随着光刺激神经组织研究的深入,越来越多的科研工作者开始探索用脉冲激光代替电极,刺激听觉神经系统,研制全新的光刺激人工耳蜗。
早在上世纪六十年代,Arvanitaki等就在单神经细胞上量化了不同波长的可见光和近红外光的辐射量对神经细胞的影响[5]。 1971年,Fork用波长488 nm的激光持续照射神经细胞,发现可以测量到神经冲动,并且神经组织没有发生明显的不可逆损伤,首次论证了光刺激的安全性[6]。此后,Hirase等使用近红外脉冲激光刺激大脑皮层的神经,证明神经元上产生的动作电位很可能与激光辐射量有关[7]。 2005年,美国范德堡大学的Wells等研究证明红外脉冲激光能安全有效地刺激大鼠坐骨神经,2~6 μm波段的中红外激光能诱发神经动作电位而不对相应组织造成损伤,并且论证了激光与组织的相互作用主要受组织中水分的吸光性影响[8]。随后,美国西北大学Richter的研究团队拓展了Wells等的工作,尝试使用红外脉冲激光刺激听觉神经系统,在豚鼠身上设计了一系列验证试验,证实通过脉冲激光刺激螺旋神经节细胞来诱发听神经冲动是可行的,并初步探究了不同的激光波长、脉冲宽度、刺激频率和脉冲能量等参数对刺激结果的影响[9, 10, 11, 12, 13],开创了光刺激人工耳蜗研究的先河。与Richter等的方案不同,德国Hannover医学院Wenzel的研究小组,利用纳秒脉冲绿光照射豚鼠耳蜗基底膜和骨螺旋板,也成功触发了听觉神经[14]。
Wells等曾论证,激光与组织间的相互作用主要受组织中水分的吸光性影响[8],不同波长的光,由于组织对其吸收和散射特性不同,具有不同的渗透深度(定义为入射光在强度衰减为初始光强37%时在组织中传导的距离)。由于外周神经80%的组成部分是水,因此,波长的变化会对组织中的光分布产生重大影响[15]。对于可见光,其波长较短,易被散射,使光能在组织中扩散,不利于精确刺激。而对于近红外长波段光,由于组织对其有很强的吸收性,为了使激光强度在通过组织衰减吸收后仍能有效刺激听神经,需要光源提供比较大的初始光能输出,这可能导致组织中热量的聚集,在安全性和持久性方面有所欠缺。
目前的机理探究实验所用的激光波长,主要集中于可见光(532 nm)和近红外长波段(1 840 nm以上),并且为了保证激光在通过耳蜗淋巴液和软组织衰减吸收后仍能有效刺激听神经,大都采用耳蜗底回打孔的方式植入光纤,以缩短光路降低能量衰减,但这会对耳蜗结构产生一定损伤。考虑到组织对近红外短波段光的散射和吸收特性介于可见光和近红外长波段光之间,能实现刺激精度和能量的优化权衡,是光刺激耳蜗波长参数理想的选择区域。然而,由于光刺激人工耳蜗起步较晚,尚处于初期探索阶段,相关研究较少,仅对808 nm波段有少量实验探究[16],难以确定合适的激光参数。
因此,本文选取该区域980 nm波长激光刺激豚鼠耳蜗,探究能否在不破坏耳蜗结构的前提下触发听觉神经,以期为光刺激人工耳蜗光学参数优化提供一定参考。
1 实验方案及实施 1.1 实验方案设计图 1是整个光学实验方案的示意图。激光控制器(LSR-PS-FA系列,宁波远明激光技术有限公司)将激光源发出的连续高功率激光,通过TTL(transistor-transistor logic)数字调制成频率和脉宽一定的脉冲激光,经耦合器(APFC-3AT,北京卓立汉光)耦合到光纤中后,导入到豚鼠耳蜗中,刺激听神经。此外,为实现光刺激与数据记录的同步,当通过计算机控制生理信号采集仪(RM6240C,成都仪器厂)记录光刺激引起的CAP(compound action potentials)电位变化时,由RM6240C产生一个上升沿触发信号使能单片机(MC9S12XS128MAL开发板,Freescale),单片机输出预先设定好的TTL信号驱动激光控制器开始工作,从而实现光刺激与数据采集的同步。
![]() |
图 1 光学平台示意图 |
选取4只200~300 g、 听力正常的Hartley豚鼠进行动物实验,豚鼠性别随机。实验前先称量豚鼠体重,根据每100 g注射质量分数为10%、1.2 mL的氨基甲酸乙酯标准,麻醉豚鼠。待动物角膜反射消失后,剪净一侧耳廓四周的毛,腹位固定在解剖台上,沿耳廓根部的后上缘切开皮肤,将耳道孔上部及后部的头骨上的皮肤及结蒂组织去除后,打开鼓室,暴露耳蜗。实验过程中,豚鼠被固定在一个专用支架上,每隔30 min给豚鼠腹腔补注射0.5 mL溶液,确保豚鼠一直处于麻醉状态,同时用一个加热垫维持豚鼠周围环境温度恒定在38 ℃左右。
1.3 信号采集待动物实验手术完成以后,将豚鼠转移到静音室中,用微操作手(MP-225,美国Sutter Instrument Company)将芯径为105 μm(包层直径 250 μm)的光纤伸入鼓室,朝向圆窗膜,同时光纤尾端不与任何耳蜗组织直接接触,方向对准蜗轴并约45°倾斜,如图 2所示。信号采集系统RM6240C生理记录仪的记录电极与放置在圆窗膜上的银球引导电极(XF100,成都仪器厂)相连,参考电极夹在耳廓皮肤创口上,接地电极与插入豚鼠背部皮肤内的银针电极相连。
![]() |
图 2 豚鼠耳蜗示意图 |
声刺激时,通过RM6240C产生强度为15 V、脉宽为0.1 ms的脉冲电压驱动音箱(SPA2380/93,上海飞利浦),产生大小为80 dB SPL短声刺激,诱发听神经动作电位。其中SPL表示声压级(sound press level)。 记录仪的采样率设置为 100 kHz,使用带通滤波方式,通带范围50 Hz到 1.0 kHz。 为避免测量误差,最后采集到的CAP,由每 2 s 一次的声刺激记录到的信号叠加平均30次得到。
光刺激与声刺激信号采集的方式基本一致,只是将刺激源由音箱发出的短声波,换成一定参数的980 nm脉冲激光,最后采集到的oCAPs(optical compound action potentials)同样通过叠加平均30次得到。
2 实验结果所有的实验数据从RM6240C生理采集仪导出后,通过Matlab 7.0读取分析。选取了4只任意性别的豚鼠进行实验,全部都在980 nm脉冲激光刺激下采集到了oCAPs信号,并分别就980 nm光刺激听神经的可行性、光刺激强度与oCAPs幅值关系以及刺激安全性这3部分进行了实验探究。
图 3为oCAPs和声致CAP信号的对比图。其中,图 3a和图 3b是使用80 dB SPL的click声刺激记录到的CAP信号; 图 3a是正向单刺激,图 3b是负向单刺激; 图中的箭头表示刺激起始点。由图 3可以看出,当采用正向click声刺激时,CAP潜伏期内的微音器电位(CM)先正后负,而采用负向click声刺激时,微音器电位先负后正,两者的相位相差180°,但都与原始刺激信号一致。图 3c是波长为980 nm、脉宽为100 μs、频率为0.5 Hz、强度为25.46 mJ/cm2 的激光刺激得到的oCAPs信号。与声刺激CAP信号波形相比,oCAPs也有明显的N1、 P1、 N2等峰值分化,存在一个1.5~2 ms左右的潜伏期。除oCAPs信号 在潜伏期内没有微音器电位(CM)外,两者的波形十分相似,说明利用980 nm 脉冲激光代替声波,刺激豚鼠听神经是可行的。
![]() |
图 3 声刺激CAP和光刺激oCAPs比较 |
为探究光刺激强度与oCAPs幅值大小的关系,将光纤输出激光的辐射能由7.64 mJ/cm2逐渐增强到30.03 mJ/cm2,结果如图 4所示。实验发现,oCAPs的产生存在一个刺激强度阈值: 当光纤尾端输出能量较低(<10.06 mJ/cm2)时,没有记录到oCAPs信号; 随着光纤输出能量的加大,听觉神经被触发,记录到的oCAPs幅值逐渐增大,且P1、 N2峰的分化越来越明显; 但是,当oCAPs幅值增大到一定程度时,继续增大刺激强度(>28.52 mJ/cm2),oCAPs的幅值并没有相应增大,而是趋于饱和甚至开始逐渐下降。可见,光刺激时要保证刺激强度超过阈值才能有效触发听神经,同时,刺激的强度不是越大越好,存在一个最佳区域范围。
![]() |
图 4 光刺激强度与oCAPs幅值的关系 |
此外,采用波长为980 nm、脉宽为100 μs、频率为0.5 Hz、光辐射强度为25.46 mJ/cm2的脉冲激光持续刺激豚鼠听神经节2 h左右后,所记录到的oCAPs幅值大小与最初记录的情况没有显著性差异,说明该参数的光刺激具有一定安全性。然而,由于实验条件受限,没有对光刺激后的耳蜗组织进行生理解剖,该参数下光刺激是否给组织造成了不可逆转的损伤,还有待更加严格的实验数据来验证。
3 讨论和分析本文实验表明:
1) 980 nm近红外短波段脉冲激光能有效刺激耳蜗听神经,获得oCAPs信号。
2) 980 nm近红外短波段脉冲激光产生oCAPs需要达到强度阈值。此外,在一定的刺激强度范围内,随着光刺激能量的增加,oCAPs信号强度逐渐增大,最后趋于饱和。
3) 980 nm近红外短波段脉冲激光长时间刺激得到的oCAPs信号和最初记录到的oCAPs信号一致,表明激光刺激具有一定的安全性。
虽然已有多个研究小组使用不同波段的激光诱发出听神经冲动,但是其内在机理尚未完全弄清。目前比较流行的解释有3种,分别是: 光化学效应(photochemical effects)假说、光压效应(photomechanical effects)假说和光热效应(photothermal effects)假说,其中光热效应假说为多数人所认同[17],本文的实验数据也与之相吻合。
根据光子学理论,980 nm红外光子的能量很低(<1.25 eV), 而一般物质分子由基态到激发态所需能量较大,通常只有波长较短(<700 nm)的光子才有足够的能量使价电子激发到高能态。 因此,980 nm红外光子没有足够的能量激发光化学反应。尤其是Richter研究小组使用波长大于1 840 nm的红外激光也成功触发听觉神经[11, 18],使用光化学效应假说无法解释这一现象。
激光刺激神经组织,会使组织热膨胀产生压力波。如果oCAPs是由压力波振动耳蜗内的淋巴液,再经毛细胞将该振动转化为神经冲动引起的,那么oCAPs信号在潜伏期内应与声刺激CAP一样存在微音器电位。然而,实验结果显示oCAPs在潜伏期内不存在微音器电位,这表明光压效应不是诱发神经冲动的原因。
在实验中,当光纤尾端输出的光强越强时,记录到的oCAPs信号强度越大而潜伏期则逐渐缩短。这是因为,随着激光输出光强增大,耳蜗组织单位时间接收到的光能增多,光热效应增强,导致耳蜗内更多的听神经在短时间内被触发。因此,oCAPs的幅值随着光刺激能量的增加而逐渐增大,潜伏期则相应缩短,这从侧面说明使用脉冲激光诱发听觉神经冲动的现象很可能是由光热效应引起。
4 结 论本文通过豚鼠活体实验得到以下主要结果:
1) 使用波长为980 nm、 脉宽为100 μs、 频率为2 Hz、 光辐射强度为7.64~30.30 mJ/cm2之间的脉冲激光,能有效地激发耳蜗听觉神经,诱发出oCAPs信号。
2) oCAPs的信号强度与刺激光强直接相关,这与光热效应假说相吻合。并且只有当刺激强度大于阈值时,才能记录到oCAPs,同时,刺激的强度不是越大越好,存在一个最佳区域范围。
3) 安全实验表明: 强度为25.46 mJ/cm2的脉冲激光持续刺激耳蜗神经组织2 h后,记录到的oCAPs信号没有发生显著性差异。这表明使用该激光参数刺激神经组织具有一定的安全性。
这些实验数据,有助于填补光刺激人工耳蜗在近红外短波研究的空白,为下一代人工耳蜗的研制提供激光参数选取方面的参考。
经过半个多世纪的发展,电刺激人工耳蜗已逐渐走向成熟。光刺激人工耳蜗由于起步较晚,目前还处于初期探索研究阶段,尚有很多热点有待探讨。首先,光刺激人工耳蜗的作用机理需要更多的实验数据来证明。其次,有关安全性检验、刺激点选择、手术方法完善等问题仍需继续探索。再次,由于目前相关刺激参数的选取几乎都是在动物身上完成验证的,基于人体的临床研究仍然是空白。最后,如何将这一原理与工程技术相结合,研发出实用的光刺激人工耳蜗产品,也是未来研究的一个重要方向。总的来说,由于光刺激具有许多电刺激无可比拟的优点,因此具有潜力巨大的应用前景。
[1] | ZENG Fangang, Rebscher S. Cochlear implants: System design, integration and evaluation [J]. IEEE Reviews in Biomedical Engineering,2008, 1: 115-142. |
[2] | Jonathon W, Chris K, Jansen E D, et al. Application of infrared light for in vivo neural stimulation [J]. Journal of Biomedical Optics, 2005, 10 (6): 1-12. |
[3] | 郗昕, 翼飞, 洪梦迪. 人工耳蜗技术报告(Ⅱ): 人工耳蜗团队 [J]. 中国听力语言康复科学杂志, 2006 (6): 36-37. XI Xin, YI Fei, HONG Mengdi. Cochlear technical report(Ⅱ): Cochlear team [J]. Chinese Scientific Journal of Hearing and Speech Rehabilitation, 2006 (6): 36-37.(in Chinese) |
[4] | Laura E M, Suhrud M R, Agnella D I, et al. Infrared neural stimulation: Beam path in the guinea pig cochlea [J]. Hearing Research, 2011, 6(6): 289-302. |
[5] | Arvanitaki A, Chalazonitis N. Excitatiory and Inhibitory Processes Initiated by Light and Infra-Red Radiations in Single Identifiable Nerve Cells [M]. Florey E, ed. Nervous Inhibition. New York, USA: Pergamum Press, 1961, 194-231. |
[6] | Fork R L. Laser stimulation of nerve cells in aplysia [J]. Science, 1971, 171(974): 907-908. |
[7] | Hirase H, Nikolenko V, Goldberg J H, et al. Multiphoton stimulation of neurons [J]. Journal of Neurobiology, 2002, 51(3): 237-247. |
[8] | Wells J, Kao C, Mariappan K, et al. Optical stimulation of neural tissue in vivo [J]. Optics Letters, 2005, 31: 235-238. |
[9] | Izzo A D, Richter C P, Jansen E D, et al. Laser stimulation of the auditory nerve [J]. Lasers in Surgery and Medicine, 2006, 38(8): 745-753. |
[10] | Izzo A D, Walsh J T, Ralph H, et al. Laser stimulation of auditory neurons: Effect of shorter pulse duration and penetration depth [J]. Biophysical Journal, 2008, 94(8): 3159-3166. |
[11] | Izzo A D, Joseph T W, Jim W, et al. Laser stimulation of the auditory system at 1.94 μm and microsecond pulse durations [J]. Optical Interactions with Tissue and Cells, 2008, 6854: 43-49. |
[12] | Richter C P, Rodrigo B, Izzo A D, et al. Optical stimulation of auditory neurons: Effects of acute and chronic deafening [J]. Hearing Research, 2008, 1(11): 42-51. |
[13] | Matic A I, Walsh J T, Richter C P. Spatial extent of cochlear infrared neural stimulation determined by tone-on-light masking [J]. Journal of Biomedical Optics, 2011, 16(11): 1-9. |
[14] | Wenzel G I, Balster S, ZHANG Kaiyin, et al. Green laser light activates the inner ear [J]. Journal of Biomedical Optics, 2009, 14(4): 4004-4007. |
[15] | Izzo A D, Joseph T W, Heather R, et al. Laser stimulation of auditory neurons: Effect of shorter pulse duration and penetration depth [J]. Biophysical Journal, 2008, 94: 3159-3166. |
[16] | XIA Nan, WANG Xing, GU Xin, et al. Pulsed 808-nm infrared laser stimulation of theauditory nerve in guinea pig cochlea [J]. Lasers in Medical Science, 2014, 29(1): 343-349. |
[17] | Jonathon W, Chris K, Peter K, et al. Biophysical mechanisms of transient optical stimulation of peripheral nerve [J]. Biophysical Journal, 2007, 93: 2567-2580. |
[18] | Izzo A D, Joseph T W, Heather R, et al. Optical parameter variability in laser nerve stimulation: A study of pulse duration, repetition rate and wavelength [J]. IEEE Transactions on Biomedical Engineering, 2007, 54(6): 1108-1113. |