基于电阻抗多模式检测芯片的体外热疗
谢新武 1,2 , 刘蔚然 1 , 刘冉 1     
1. 清华大学 医学院, 生物医学工程系, 北京 10084 ;
2. 军事医学科学院 卫生装备研究所, 天津 300161
摘要:热疗是继手术、化疗、放疗之后对癌症的一大治疗手段,但是目前其机理尚不明确,体外研究结论与临床应用尚有差距。为更好地研究在热应激/热疗过程中的细胞变化,该文构建了一套集成细胞电阻抗非标记动态检测、细胞形态动态记录、荧光标记检测功能并且能够自动测控温度的微全分析系统,对其控温性能进行了仿真与实测检验,对细胞培养及增殖过程进行了非标记连续监测,并利用此实验系统进行了癌细胞在2种热疗条件下的动态多模式检测。实验结果表明:HeLa细胞在41℃,2 h热疗作用下,阻抗呈现“V”型变化,形态快速收缩后又迅速恢复贴壁,荧光标记检测显示细胞活力无明显改变;而在2次55℃,2 min脉冲式热疗作用下,细胞阻抗呈现“L”型变化,细胞杀伤效果明显。该系统将传统标记技术与非标记检测技术结合,可用于细胞热应激/热疗的相关研究。
关键词细胞-基质电阻抗测量     热疗     芯片实验室     多模式检测    
In vitro hyperthermia based on a multi-mode detection chip with impedance sensing
XIE Xinwu1,2 , LIU Weiran1 , LIU Ran1     
1. Department of Biomedical Engineering, School of Medicine, Tsinghua University, Beijing 100084, China ;
2. Institute of Medical Equipment, China Academy of Military Medical Sciences, Tianjin, 300161, China
Abstract:Hyperthermia is a useful method for cancer treatment after surgery, chemotherapy and radiotherapy for numerous types of cancers. However, the mechanism is not yet fully understood and some in vitro results cannot be repeated in clinical applications; thus, further research is needed. In this study, a lab-on-a-chip device and a corresponding detection system was constructed to study in vitro hyperthermia. The device incorporated electric cell-substrate impedance sensing (ECIS), morphological imaging, and fluorescence observation during and after cells were thermally treated in situ with automatic on-chip temperature control. The temperature control was tested in an incubator. The cell culture and impedance sensing were also validated. Then, cancer cells were treated and monitored by the system for two hyperthermia conditions. The impedance curve with rectangle hyperthermia control of 41℃ for 2 h shows a "V" shape change during the 41℃ treatment with the cells quickly shrinking and re-adhering without any obvious viability changes in the fluorescent labeling images. However, two hyperthermia pulses at 55℃ for 2 min caused cell impedance "L" shape changes and killed most of the cells. These results demonstrate that this device with un-labeled and labeled methods is a useful tool for in vitro research on thermal therapy.
Key words: electric cell-substrate impedance sensing (ECIS)     hyperthermia     lab on a chip     multi-mode detections    

热疗被认为是继手术、 放疗、 化疗之后的一大癌症治疗手段,特别是临床上与化疗、 放疗联合使用时都体现了良好的效果[1-2]。 然而,癌症热疗现在面临着诸多挑战,其中之一就是机理尚未厘清,细胞水平研究结果与临床实际应用效果差异明显,因而需要进一步研究[3-5]。 在细胞热疗研究过程中,传统的实验方式通常是对细胞进行一定时间的水浴加热,通过噻唑蓝(MTT)比色法等方法进行细胞活力检测,通过一些标记的方法进行分子机理研究等。 热疗过程与在体内正常生长环境、 培养箱培养环境均不相同,检测方式都是单次有损检测,难以对细胞变化的完整过程进行跟踪,对其变化的细节无法描述。 细胞—基质电阻抗测量(electric cell-substrate impedance sensing,ECIS)技术作为一种非标记的原位检测技术,在细胞生物学行为[6]、 癌症研究[7]、 药物筛选[8]等方面有广泛应用。 相比传统的方法,该技术能够自动完成细胞原位的状态检测而不影响细胞的正常生长状态,因而具有通量高、 样品试剂消耗少、 省时省力等优点。 由于能对细胞状态进行连续的全程监测,将其应用于癌细胞热疗研究,能对热疗过程中及热疗后细胞状态变化进行精细描述,从而有望发现新的现象,为深入的机理研究提供支撑。

本文构建了基于ECIS技术的原位细胞多模式检测控制芯片,集成了培养箱环境内细胞在芯片上原位贴壁、 生长、 增殖等状态的连续检测,热刺激/热疗过程的自动加载与控制,细胞形态学的连续检测及荧光标记的定点检测等功能,并初步应用于癌细胞的热疗研究。

1 实验平台构建

将ECIS检测与加热控制功能集成到一个芯片上,并通过芯片外围的显微镜成像系统实现对细胞形态观察及荧光标记检测(见图 1)在整个实验过程中,芯片和检测系统都位于细胞培养箱内,从而保证细胞培养环境的稳定性。 整个实验平台包括集成芯片、 ECIS检测系统、 形态观察及荧光标记检测系统、 温度检测及加热控制系统等4个部分。

图 1 实验平台位于培养箱内的部分

1.1 集成芯片

集成芯片组成见图 2,包括印刷电路板(printed circuit board,PCB)、 氧化铟锡(indium-tin oxide,ITO)玻璃、 金电极阵列玻璃芯片、 热电偶(K型)、 聚二甲基硅氧烷(polydimethylsiloxane,PDMS)细胞培养腔室以及透明有机玻璃(PMMA)盖板等。 其中,金电极阵列玻璃芯片采用微电子加工工艺制作而成[9],每个芯片上4个对称的电极单元采用叉指电极的形式(见图 3),叉指的宽度W和间距D分别为20和200 μm,这样的参数组合保证了对细胞电阻抗检测灵敏度比较高[10],同时保证了较好的透光性,利于形态观察和荧光标记检测功能的集成。 PDMS培养腔室与金电极芯片基底通过常规Plasma等离子清洗、 键合的方式实现紧密结合,并将直径0.2 mm的热电偶固定在芯片底部,从而确保热电偶检测到细胞所在部位温度。 ITO玻璃与金电极芯片紧密贴合,边缘通过环氧胶在玻璃边缘粘合固定形成一体化芯片。 ITO玻璃一面覆盖有透明的ITO层,具有良好的导电性和透光性,在通电情况下能对细胞加热,且与光学检测兼容。 印刷电路板实现对2组芯片的阻抗检测电极及ITO玻璃的良好电气连接,并与后端的检测、 控制系统连接。 每组芯片可以独自控制温度,而芯片上4个对称的检测单元则实现了实验条件的完全统一,可实施多个重复实验。

图 2 芯片构成

图 3 叉指电极单元

1.2 电阻抗检测系统 1.2.1 ECIS原理

ECIS技术 [11]是一种能够对贴壁生长的细胞的生物学行为进行实时监测的电学测量方法。 以微电极阵列为基底构建ECIS芯片,并在芯片上进行细胞培养。 如果在微电极上施加微弱的交流激励信号,并测量电极之间的阻抗,贴壁细胞会造成体系阻抗的增加。 当细胞数量、 细胞形态、 细胞与基底之间的贴附状态等发生变化时,所测量的阻抗便会将这种变化实时地揭示出来。 ECIS技术使用的微弱交流电信号本身对细胞是没有伤害作用的,因此是一种典型的非标记、 无损检测技术。 ECIS检测的频率范围(约100 Hz~100 kHz)、 电极的形状、 间距等需要进行设计与优化,才能获得足够的灵敏度; 同时由于信号比较微弱,对检测系统的抗干扰能力要求较高。

1.2.2 ECIS检测系统

电阻抗检测系统包括检测电路、 NI DAQ PCI-6110数据采集卡和Labview采集软件。 其中,检测电路与前述PCB板相连,实现对信号的初步放大、 滤波,再送入数据采集卡; 数据采集卡能产生一定频率的正弦信号通过检测电路施加到芯片上,并对检测到的阻抗信号进行处理; Labview采集软件是对数据采集卡进行可视化控制及数据处理、 显示的界面。 在经过优化后[12],进行阻抗检测的基本参数是: 信号幅值为10 mV,频率为60 kHz,波形为正弦波。 系统的详细介绍参见文[8]

1.3 形态观察及荧光标记检测系统

芯片的腔体各部件都采用了透明材料,实现了与光学系统的兼容。 形态观察及荧光标记检测系统是一个带有CCD的单镜头的倒置显微镜系统(见图 1)以及用于拍摄控制的上位机软件。 系统集成了白光(功率为5 W)、 蓝紫激光(波长为405 nm,功率为80 mW)、 绿色激光(波长为532 nm,功率为80 mW)3路光源,光源均采用LED冷光源,功率低发热量小,不会对培养箱内温度场造成影响。 白光光源用于明场照明及细胞形态的连续监测; 激光光源用于荧光标记检测,分别能检测绿色荧光和红色荧光,可用于多数的荧光标记检测。 基于Matlab 2014a的上位机软件通过一个单片机电路对光源的照明时间进行控制,以一定的间隔时间对细胞形态进行采样,只在需要观察细胞状态和拍摄照片时打开白光光源,只在对细胞进行荧光标记后在关键的数个时间节点进行荧光信号采样并严格控制曝光时间,结束采样后立即关闭光源,每次激光照射约2 s,从而在确保获得实验数据的情况下几乎不对细胞状态造成额外影响。 图 4显示了同一个样品在明场、 绿色荧光和红色荧光通道下的照片。

图 4 显微镜明场,绿色荧光和红色荧光照片

1.4 温度检测及加热控制系统

采用PID控制器(控温精度0.5 ℃)通过芯片上热电偶对细胞温度实时采样,对ITO层通过脉宽调制的直流电压(+12V)执行加热,芯片的两层玻璃实现快速传热与冷却。 PID控制器对加热过程进行闭环控制,实现对芯片上细胞的温度精确控制,从而确保热疗实验温度的精确、 可控。

1.5 芯片温度场仿真与优化

现有热疗研究结果表明热对细胞的杀伤与细胞受热的温度、 受热时间紧密相关,因此热疗实验对温度的精度、 稳定性、 升降温速度都提出了较高的要求。 本文通过对芯片结构进行热场仿真和优化设计,并进行实测检验,保证温度控制效果。

采用Comsol仿真软件对芯片温度场进行仿真,并依据仿真结果优化芯片设计。 利用电流壳(electric current,shell)和固体内热传递(heat transfer in solid)模块对该模型进行多物理场耦合仿真分析。 通过对ITO玻璃施加直流电压,ITO层(厚度200 nm)发热后通过两层玻璃(各厚1.1 mm)传导到上层金电极表面,从而对细胞进行加热。 芯片上的细胞培养基、 PDMS等均会一定程度吸收热量,对芯片上的热场产生影响。 设ITO层两端电压为1.8 V,电导率为106 S/m,外界温度为37 ℃,表面与外界的对流换热量为8 W/(m2·K),将玻璃、 培养基、 PDMS的密度、 比热容、 导热系数代入模型,得到仿真结果。

通过仿真优化,芯片的ITO加热板采用正方形,与金电极芯片一样采用对称设计,在相对的两侧各设计3个以上均匀排布的电气连接点,从而实现芯片上四个孔间温度的均一性以及孔底部细胞层温度的均匀性。 图 5给出温度仿真的结果,当芯片温度控制在43 ℃左右(热疗常用的温度)时,四个孔细胞层温度均一性良好,孔内温差小于0.1 ℃。

图 5 芯片温度场仿真结果

最终实验系统在一个5 cm5 cm芯片及其附属的检测系统上实现了细胞在线培养、 阻抗连续检测、 快速精确加热、 细胞形态成像记录、 荧光标记检测等功能,从而构建出一个细胞热疗的全过程原位培养—刺激—分析系统。

2 实验及结果 2.1 芯片温度控制性能测试

对芯片的温度控制效果进行实测。 采用安捷伦数据采集器34970A对同一芯片上四个通道同步进行控温加热过程的温度检测,结果如图 6所示。 可以看出,当培养箱内环境温度(对照温度)稳定为37 ℃时,芯片细胞培养孔内(芯片孔内温度)的升温极限达到65 ℃,从37度升到41 ℃的时间约为2.5 min,系统从约64 ℃降到40 ℃以下需要约27 min,降到38 ℃以下则需要约55 min,从41 ℃降到38 ℃需要约14 min。 可见系统的升降温速度很快,达到2.7 ℃/min。 从图 6c-e可以看出,四个孔内(芯片孔1—4)的温度均一性保持良好,在不加热(37 ℃)时芯片孔1—4孔间温度检测最大偏差值约为0.2 ℃(图 6d),加热到41 ℃并维持该温度时,芯片孔1—4孔间温度检测最大差值约为0.4 ℃,对于单一腔体内温度曲线,在快速上升到目标温度(41 ℃)之后,其温度均稳定在目标值之上,波动幅度约为0.5 ℃(图 6e)。 由此,系统的升降温速度、 各腔体内温度均一性、 单一腔体内温度稳定性都得到有力保证。

图 6 芯片温度控制效果

2.2 细胞培养与贴壁、 增殖过程检测

在芯片上培养细胞,对细胞从贴壁、 伸展到增殖的全过程进行监测。 HeLa细胞以105/mL的密度悬浮于DMEM培养基(含体积比10%胎牛血清和1%的双抗)中,每个培养腔体加入600 μL悬浮了细胞的培养基,全程培养箱内培养。 同步进行阻抗和形态学连续监测,ECIS传感器对细胞进行全程检测,显微镜系统白光明场对细胞延时拍照,二者间隔时间均为5 min。

图 7a为阻抗幅值曲线,随着细胞悬液加入,阻抗幅值逐渐增长,直到约18 h后达到平台期。 图 7a中箭头1—5分别对应图 7b中依次拍摄的形态照片时间点。 图 7b的同步形态照片中黑色粗斜线为不透光的金电极,可以看到: 细胞从一开始的悬浮状态下的圆形,逐步变成不规则的梭形,可见是细胞贴壁的一个过程; 随后单个细胞贴壁的面积不断扩大,同时细胞数量也增加,直到最后形成对底面完全覆盖的单细胞层,此时电阻抗幅值达到平台期,不再有明显增长。 可见原位细胞形态连续成像能够对细胞的贴壁-增殖过程进行监测,看到细胞变化的动态过程; 而ECIS检测的阻抗幅值可以给出细胞增殖的定量结果。 由此,实验系统可以对细胞的活力状态进行定性(形态)和定量(阻抗)的连续在线监测,且二者之间相互印证。

图 7 培养箱内37 ℃培养条件下细胞贴壁生长、 增殖的电阻抗曲线

2.3 癌细胞热疗全程多模式监测

对转染了绿色荧光蛋白(green fluorescence protein,GFP)的HeLa细胞进行芯片上培养,观察形态及阻抗幅值,确认达到平台期后,对细胞进行热疗处理。

2.3.1 方波式热疗及结果

处理的条件是: 41 ℃维持2 h,这是临床全身热疗单次治疗的常用处理条件。 在热疗过程中,对细胞的温度、 阻抗、 形态进行连续观察,结束后4.5 h加入碘化丙啶(propidium iodide,PI)染色。 在热疗开始时、 结束时、 结束4.5 h后分别对细胞进行原位荧光成像检测。

图 8a的温度监测曲线可以看到,细胞的温度在快速升到41 ℃后,一直维持在41—41.5 ℃之间,波动较小,2 h后又快速恢复到细胞正常培养所需温度; 此时图 8b的热疗组细胞电阻抗幅值显示出一条“V”型变化曲线,逐渐下降到接近0的水平,结束后又恢复到接近热疗前的水平,而对照组的阻抗曲线变化不大,可见高温确实对细胞状态造成了影响,细胞产生了应激反应; 图 8b中箭头1—3分别对应图 8c中明场和荧光照片拍摄时间点。 明场形态照片(图 8c第1行)可以看出此时细胞的形态发生了明显的变化: 由不规则的梭形贴壁形态变成了缩小的圆形,由此可见阻抗的变化与形态的收缩有很强的相关性。 热疗结束4.5 h后,细胞阻抗已经恢复到接近热疗前的水平,从形态上看,细胞部分恢复了类似热疗前的贴壁状态,但与热疗前仍有明显区别,可见细胞阻抗的恢复与其恢复到贴壁有关,但又不能完全用形态的变化解释。 从荧光成像的结果来看,细胞的绿色荧光照片(图 8c第2行)显示视野内的细胞绿色荧光在热疗前后无明显变化,所有荧光物质都在完整的细胞内部,可见细胞在热疗过程中绿色荧光蛋白本身和其表达量没有明显变化,同时红色荧光照片(图 8c第3行)在加入PI染色后无明显亮点,说明视野内无死亡细胞,因而细胞的活力无明显的变化。

图 8 GFP-HeLa细胞41 ℃热疗的温度、 阻抗曲线以及细胞形态与荧光照片对比

2.3.2 脉冲式热疗及结果

在细胞增殖到平台期后,采用两次脉冲式热疗,当温度达到55 ℃时,维持2 min,开始自然降温,恢复到38 ℃后,再重复上次脉冲式热疗过程,两次脉冲式热疗共耗时2 h。 热疗结束后继续培养15 h,加入PI染色。 在热疗开始前和结束 15 h 后分别进行原位荧光成像检测,结果如图 9所示。

图 9 GFP-HeLa细胞55 ℃脉冲式热疗的温度、阻抗曲线以及细胞形态与荧光照片对比

图 9可知,脉冲式温度曲线(见图 9a)导致热疗组阻抗(见图 9b)快速下降,并且热疗组阻抗幅值相比对照组一直没有明显恢复的过程,呈现出“L”型变化。 图 9b中1和2分别对应图 9c中拍摄明场和荧光照片的时间点。 在热疗开始时和结束15 h时的形态(图 9c第1行)和荧光检测结果可以看到,细胞的形态边界模糊,绿色荧光(图 9c第2行)由初始的明显出现到最后无明显荧光,说明基本无GFP蛋白表达,PI染色可见多数细胞发出红色荧光(图 9c第3行),表明细胞已经死亡。 由此可以判断,细胞在热疗作用下活力丧失,细胞死亡。 由脉冲式温度曲线可以看到,温度处于43 ℃以上的时间大约有1 h,根据等效热剂量原理[4],细胞实际受热剂量大大超过43 ℃热疗 1 h,因此细胞杀伤效果明显,且与已有研究结论相符。

3 结 论

本文将非标记的ECIS技术与细胞形态观察、 荧光标记检测相结合,在精确控温、 细胞培养箱内原位加热与检测的基础上,实现了对细胞在热疗过程中和热疗后状态变化的连续监测,对全过程进行扫描,从而有利于对热疗实验过程进行精细控制,对热致细胞变化过程的所有细节全程掌控; 在非标记检测的基础上,将荧光标记检测与之结合,进一步提高检测的特异性、 针对性,以及检测时间点的精确性。 在实现以上功能的基础上对癌细胞进行了方波式及脉冲式热疗,并进行了结果分析,与已有的结论相符。 该平台作为细胞热疗实验新的研究工具,有望对癌细胞热疗的相关研究起到重要推动作用。

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