提高角度法SPR检测系统分辨率的方法

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窦福印, 王鹏, 余兴龙. 提高角度法SPR检测系统分辨率的方法. 清华大学学报: 自然科学版, 2014, 54(2): 202-206[Fuyin DOU, Peng WANG, Xinglong YU. Improved resolution for SPR detection systems with angular modulation[J]. 2014, 54(2): 202-206] 复制到剪切板

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提高角度法SPR检测系统分辨率的方法

窦福印, 王鹏, 余兴龙

清华大学精密仪器系, 精密测试技术及仪器国家重点实验室, 北京 100084

余兴龙, 教授, E-mail:jyxyxl@mail.tsinghua.edu.cn

作者简介: 窦福印(1985—), 男(汉), 河北, 博士研究生。

基金:国家自然科学基金资助项目 (30970757);

摘要

提高表面等离子共振(surface plasmon resonance, SPR)检测系统的分辨率有利于扩大其应用。该文围绕角度检测方法,从理论上阐明了检测系统的分辨率不仅随着灵敏度的增强而改善,而且随着半峰宽的变窄而提高。同时,深入分析了使用金、银以及金银膜的分辨率,明确金银膜的分辨率比金膜高,提出采用金银膜的芯片来提高系统的分辨率。以不同质量分数的NaCl溶液为介质,分别测量使用金膜和金银膜时的分辨率。实验结果表明,金膜和金银膜各自对应的分辨率为5.2×10^-6 RIU (refractive index unit)和 3.9×10^-6 RIU, 后者较前者提高1.4倍,与理论分析结果1.6倍接近。

关键词: 表面等离子共振(SPR); 系统分辨率; 灵敏度; 金银膜

中图分类号:R197.39 文献标志码:A 文章编号:1000-0054(2014)02-0202-05

Improved resolution for SPR detection systems with angular modulation

Fuyin DOU, Peng WANG, Xinglong YU

State Key Laboratory of Precision Measurement Technology and Instruments, Department of Precision Instruments, Tsinghua University, Beijing 100084, China

Fund:

Abstract

Improved system resolutions for surface plasmon resonance (SPR) will enable applications in more fields. This paper shows theoretically that the resolution of SPR with angular modulation is not only improved with increased sensitivity, but also with a narrower half-peak width. The resolutions with Au, Ag and Au-Ag chips show that the resolution of the Au-Ag chip is higher than that of the Au chip. Thus, the system resolution can be improved by using the Au-Ag chip. Measurements of the resolution of Au and Au-Ag chips using NaCl solutions with different mass fractions show that the Au and Au-Ag chip resolutions are 5.2×10^-6 and 3.9×10^-6 RIU (refractive index unit). Thus, the Au-Ag chip resolution is 1.4 times higher than the Au chip, similar to the theoretical result being 1.6 times higher.

Keyword: surface plasmon resonance (SPR); system resolution; sensitivity; Au-Ag chip

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表面等离子共振(surface plasmon resonance, SPR)传感器已在环境监测、食品检测、药物发现与开发、蛋白质组学等研究中得到广泛应用。随着新药发现的深入开展,小分子成分已成为重要的药靶,因此迫切要求提高SPR检测系统的分辨率^[1,2]。

在角度、光强和相位3种SPR检测方法中,角度法具有结构简单、动态范围大以及线性度好等优点^[3],在20世纪90年代初就被仪器化,并且提高分辨率的研究一直在持续。定翔等^[4]通过优化金属膜厚度、入射角以及采用纳米颗粒来增强灵敏度, Zynio等^[5]和Biow等^[6]将金膜对表面折射率更敏感和银膜呈现共振曲线更狭窄的特性组合构成双层金属膜来增强灵敏度,以此提高分辨率。Johansen等^[7]利用二象限光电探测器和采用二象限信号差和比的方法抑制系统噪声,获得高分辨率; Tao等^[8]则认为检测器、 A/D转换器和找凹点算法(dip-finding algorithm)影响分辨率,且量化分析。这些方法基本上适合于3种SPR检测方法。可是,角度法与其他2种方法有所不同,后面2种方法是在固定入射角下检测光强或相位,前者却是在入射角不断变化的状态下确定谐振角。本文深入研究金、银以及金银膜的灵敏度与分辨率关系,发现了角度法有别于其他2种方法的固有性质,提出了“银膜衬底,金膜覆盖其上,构成金银膜”,以其来提高检测系统的分辨率。理论分析和实验结果表明,这种方法能使分辨率提高1倍以上。

1 理论分析

1.1 2层金属膜的SPR传感模型

棱镜耦合型SPR传感器在入射角为 θ时,其反射率 R可用3层结构的Fresnel复反射系数形式表示^[9]。金属膜为2层,应采用4层结构的模型,可表示为

$\begin{matrix} \begin{matrix} R = | r_{0,1, 2,3} |^{2} = \\ {|\frac{r_{01} + \frac{r_{12} + r_{23} \exp (2 i K_{z 2} d_{Au})}{1 + r_{12} r_{23} \exp (2 i K_{z 2} d_{Au})} \exp (2 i K_{z 1} d_{Ag})}{1 + r_{01} \frac{r_{12} + r_{23} \exp (2 i K_{z 2} d_{Au})}{1 + r_{12} r_{23} \exp (2 i K_{z 2} d_{Au})} \exp (2 i K_{z 1} d_{Au})}|}^{2} . (1) \end{matrix} \end{matrix}$

式中: r₀₁, r₁₂, r₂₃为各相邻界面上反射光与入射光的振幅比; K_z₁, K_z₂为在银、金膜中垂直于薄膜方向的波矢分量; d_Ag、 d_Au分别为银和金膜的厚度。

1.2 衰减全反射曲线

图1为以纯水为介质根据式(1)计算得到不同金属膜的衰减全反射(attenuated total reflection, ATR)曲线。其中: 入射光的波长为635 nm, 棱镜的相对介电常数为2 .299 1, 金、银和纯水的相对介电常数分别为-9.80+1.97i、 -14.48+1.09i和 1.779。从图1中可见,银和金膜的最佳厚度分别为48 nm和41 nm, 金银膜介于其间。银膜的谐振角最小,半峰宽最窄; 随着其在2层膜中的厚度减小,谐振角变大,半峰宽展宽,最终接近金膜的谐振角和半峰宽。根据图1还可求出, 5条曲线的半峰宽 W_θ( W_θ=θ₂ -θ₁)分别约为3.5°、 5°、 7°、 10°、 12°, 对应的谐振角 θ分别为69.7°、 70.9°、 72.7°、 73.6°、 73.9°。

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	图1 不同金属膜的数值模拟ATR曲线

如果SPR检测系统的硬件和共振角的解算法已确定,那么系统的输出噪声为^[10]

$\begin{matrix} σ_{out} \propto Δ \frac{W_{θ}}{d_{r}} . (2) \end{matrix}$

式中: Δ为检测系统噪声,检测系统的硬件和解算法确定后为定值; d_r为SPR峰的深度,同一系统中基本相等。由式(2)可知,半峰宽越窄,输出噪声越低,反之越大。很明显,银膜、金银膜与金膜相比较,不仅半峰宽窄,有利于降低系统噪声,而且谐振角小,有利于系统的紧凑设计。但银膜容易氧化,金膜覆盖其上即可避免。

1.3 灵敏度

角度法SPR传感器的灵敏度是指折射率与谐振角之间的比值^[11],

$\begin{matrix} S_{θ} = \frac{{ε^{R}}_{m} \sqrt[]{- {ε^{R}}_{m}}}{({ε^{R}}_{m} + ε_{s}) \sqrt[]{{ε^{R}}_{m} (ε_{s} - ε_{p}) - ε_{s} ε_{p}}} . (3) \end{matrix}$

式中: $\begin{matrix} ε_{m}^{R} \end{matrix}$ 为金属介电常数的实部; ε_p, ε_s分别为棱镜和传感层的介电常数。令 ε_p为2 .299 1, 根据式(3)数值模拟灵敏度与 $\begin{matrix} ε_{m}^{R} \end{matrix}$ 、 ε_s的关系,结果如图2所示。可见, S_θ受 $\begin{matrix} ε_{m}^{R} \end{matrix}$ 影响, $\begin{matrix} ε_{m}^{R} \end{matrix}$ 越大, S_θ越高。金膜的 $\begin{matrix} ε_{m}^{R} \end{matrix}$ 大于银膜,因而前者的灵敏度高于后者,金银膜的灵敏度则介于两者之间。此外, S_θ还受 ε_s影响, ε_s增大, S_θ增高。

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图2 灵敏度与<inline-formula><mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="Mml9-1000-0054-54-2-202"><mml:mtable frame="none" columnlines="none" rowlines="none"><mml:mtr><mml:mtd><mml:maligngroup/><mml:mrow><mml:msubsup><mml:mrow><mml:mi>ε</mml:mi></mml:mrow><mml:mrow><mml:mi>m</mml:mi></mml:mrow><mml:mrow><mml:mi>R</mml:mi></mml:mrow></mml:msubsup></mml:mrow></mml:mtd></mml:mtr></mml:mtable></mml:math></inline-formula>、ε<sub>s</sub>的关系

传感层折射率若在小范围内变化,灵敏度则可近似为定值,能通过线性拟合得到。以图3为例,它是一种金银膜上介质折射率变化后产生的一组ATR曲线,将各条ATR曲线的谐振角与对应的折射率线性拟合,得到结果如图4所示。可见,金膜和银膜的灵敏度分别为161(°)/RIU(refractive index unit)和135(°)/RIU, 金银膜的灵敏度介于两者之间,且随着银膜厚度变小而提高,依次为148(°)/RIU、 152(°)/RIU和160(°)/RIU。显然,金银膜的灵敏度低于金膜,并不能提高灵敏度, Zynio等^[5,6]认为其能改善灵敏度并不确切。但是,在光强与相位法中,银膜比金膜的灵敏度高^[12],其理论基础是:

令某一入射波长下金属的折射率 n=k+ηi( k和 η为常数), 灵敏度与金属的折射率关系为

$\begin{matrix} S \propto \frac{(k^{2} - η^{2})^{\frac{3}{2}}}{kη} . (4) \end{matrix}$

式中: | $\begin{matrix} ε_{m}^{R} \end{matrix}$ |=k² -η²; $\begin{matrix} ε_{m}^{I} \end{matrix}$ 为金属介电常数的虚部, $\begin{matrix} ε_{m}^{I} \end{matrix}$ =2 kη。因此,式(4)又可以表示为

$\begin{matrix} S \propto \frac{| {ε^{R}}_{m} |^{\frac{3}{2}}}{{ε^{I}}_{m}} . (5) \end{matrix}$

由式(5)可得出: 在光强与相位法中,灵敏度不仅和金属介电常数实部有关,而且和虚部也有关,取决于两者的比值。角度法与虚部无关,只由实部确定,这一差异决定了3种SPR方法各自的特点。

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	图3 某种复合膜的ATR曲线

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	图4 不同金属膜的谐振角与折射率线性拟合曲线

1.4 分辨率

分辨率是指检测系统所能检测出的最小折射率变化。角度法SPR检测系统的分辨率可表示为^[10]

$\begin{matrix} σ_{RI} = \frac{σ_{out}}{S_{θ}} . (6) \end{matrix}$

将式(2)代入式(6), 分辨率与灵敏度以及半峰宽的关系可表示为

$\begin{matrix} σ_{RI} \propto \frac{W_{θ}}{S_{θ} d_{r}} . (7) \end{matrix}$

由式(7)可计算得到同一检测系统中不同金银膜所对应的分辨率,如表1所示。

表1 同一检测系统中不同金属膜所对应的分辨率

由表1可得出: 银膜的分辨率比金膜提高了约2.9倍; 金银膜的分辨率随银膜厚度变薄而降低, 3种金银膜分别提高约2.2、 1.6和1.2倍。

式(7)表明,分辨率既随着灵敏度的增强而提高,又随着半峰宽的变窄而提高。灵敏度与介电常数实部成正比关系,实部越大,灵敏度越高。半峰宽与介电常数虚部成正比关系,虚部越大,半峰宽越宽^[13]。很明显,提高系统分辨率的有效途径是选择一种金属,其介电常数的实部大而虚部小。目前,还没有这种理想的材料。金银膜同时利用金的实部较大和银的虚部较小的优势,应是较理想的材料。

2 实验研究

2.1 实验装置与芯片制备

本文检测系统为自行研制的振镜扫描SPR检测装置^[14]。入射光在振镜反射镜的驱动下作角度扫描,范围为67°~85°, 对应折射率检测范围为 1.330~1.385。

传感基片为K9载玻片。镀膜前先用等离子清洗机清洗8 min, 再在丙酮溶液中超声清洗3 min后,氮气吹干,接着在去离子水中超声清洗3 min后,氮气吹干。

镀膜由中科院半导体所负责完成,采用Denton公司Explorer 14型超高真空电子束蒸发镀膜机,指示精度为0.1 nm。先蒸镀2 nm的Cr作为粘附层,接着蒸镀42 nm的金。同样,在镀Cr膜后依次蒸镀27 nm的银和15 nm的金,作为金银膜芯片。

2.2 ATR曲线和角度分辨率测试

实验步骤: 先将金膜芯片装入检测系统中,再用蠕动泵以30 μL/min的速度把去离子水注入流体池。接着,启动检测系统,待光强稳定后测得其ATR曲线并用重心法解算出谐振角,同样可测得金银膜芯片的曲线和谐振角,如图5所示。图6所示为这2种芯片的测量基线噪声。图6表明金膜芯片的基线噪声高于金银膜。系统的角度分辨率定义为基线噪声的标准差,根据图6中的基线噪声,可计算出金膜和金银膜各自所对应的角度分辨率为10×10^-4(°)和7×10^-4(°), 金银膜高于金膜。

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	图5 测得的ATR曲线

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	图6 根据实验数据计算得到的测量基线

2.3 灵敏度测试

将金膜芯片装入检测系统,再按前述方法依次将折射率为1.333的纯水以及折射率为1.338、 1.342、 1.347、 1.351、 1.360、 1.369的NaCl溶液注入流体池,实时测出对应的ATR曲线并解算出各自的谐振角,得到拟合曲线。同样可得到金银膜的拟合曲线,结果如图7所示。拟合曲线的斜率即为灵敏度。由图7可得出,金膜和金银膜的灵敏度分别约为190(°)/RIU和179(°)/RIU, 金膜的灵敏度高于金银膜。

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	图7 测得谐振角与对应折射率的拟合曲线

3 结果与讨论

3.1 ATR曲线

图5的2条曲线分别与图1中对应的3#和 5#曲线比较后,可以看出金银膜的谐振角和半峰宽都小于金膜,这表明实验结果与理论分析一致。同时,还可见测得的ATR曲线反射率不能到达0, 且半峰宽较仿真结果有所展宽。产生这种情况的原因可能有以下3点: 1) 仿真计算时将各层介质认为是理想的平面膜,实际却有一定粗糙度; 2) Cr 粘附层可能对SPR信号产生不利影响; 3) 膜厚偏离理论值,用椭偏仪(V-VASE, J. A. Woollam Co. Inc)测得金膜芯片上的Cr和金的膜厚分别为(2.859±0.787) nm和(42.118±1.444) nm, 金银膜芯片上的Cr、银和金的膜厚分别为(2.373±0.368) nm、 (26.88±0.361) nm和(13.739±1.167) nm, 都有误差。

3.2 灵敏度

从图7中2条拟合曲线可得出金膜和金银膜的实际灵敏度分别为190(°)/RIU和179(°)/RIU。从图4中的3#和5#拟合曲线得出其理论灵敏度分别为161(°)/RIU和152(°)/RIU。二者比较可以发现: 1) 金膜的灵敏度高于金银膜,实验结果与理论分析一致; 2) 测得的灵敏度高于理论值,其差不大。究其原因,主要是Cr的介电常数实部比金大,实部越大,灵敏度越高,因而引起这种误差。

3.3 分辨率

测得系统的灵敏度 S_θ和角度分辨率 σ_θ后,就可得出检测系统的分辨率 σ_RI,

$\begin{matrix} σ_{RI} = \frac{σ_{θ}}{S_{θ}} . (8) \end{matrix}$

将测得的金膜和金银膜的灵敏度和角度分辨率数据代入式(8), 可得到对应的分辨率分别为5.2×10^-6 RIU和3.9×10^-6 RIU, 后者高于前者,这与理论分析结果一致,且后者约为前者的1.4倍,理论结果是1.6倍,略有差异。其原因是在利用式(7)和(8)计算理论和实验分辨率时,各参数的实测值都偏离理论值。

4 结论

本文通过理论分析和实验结果表明,角度法SPR检测系统的分辨率不仅随着灵敏度的增强而提高,而且随着半峰宽的变窄而提高,因而金银膜的主要贡献是提高检测系统的分辨率,而不是灵敏度。实验结果表明,金膜和金银膜所对应的分辨率分别为5.2×10^-6 RIU和3.9×10^-6 RIU, 后者为前者的1.4倍,与理论分析结果1.6倍接近。此外,金银膜的制备成本也较低,更有利于其大量应用。

The authors have declared that no competing interests exist.

参考文献

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... 随着新药发现的深入开展,小分子成分已成为重要的药靶,因此迫切要求提高SPR检测系统的分辨率^[1-2] ...

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... 在角度、光强和相位3种SPR检测方法中,角度法具有结构简单、动态范围大以及线性度好等优点^[3],在20世纪90年代初就被仪器化,并且提高分辨率的研究一直在持续 ...

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定翔, 余兴龙, 耿俊清. 表面等离子体共振生物传感技术及仪器化的过去、现在与未来[J]. 现代科学仪器, 2012, 3: 124-134.

DING

Xiang

, YU

Xinglong

, GENG

Junqing.

Development history of surface plasmon resonance biosensor technology and instrumentation[J]. Modern Scientific Instruments, 2012, 3: 124-134. (in Chinese)

表面等离子共振生物传感是一种光学检测技术,可获得生物分子相互作用的特异性、亲和力和动力学常数等,无需对研究的分子进行标记、灵敏度高且可实时检测,已在生命科学的发展中发挥了重要作用,正在成为蛋白质组学研究和药物发现与开发的有力工具。本文详细回顾了该技术从物理现象发现到理论体系的完善,以及从实验室研究到仪器商品化的发展历程,概述了各个时期的研究特点、仪器化以及应用情况,探讨了有待解决的问题,并展望了未来的发展趋势。

... 定翔等^[4]通过优化金属膜厚度、入射角以及采用纳米颗粒来增强灵敏度, Zynio等^[5]和Biow等^[6]将金膜对表面折射率更敏感和银膜呈现共振曲线更狭窄的特性组合构成双层金属膜来增强灵敏度,以此提高分辨率 ...

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... 显然,金银膜的灵敏度低于金膜,并不能提高灵敏度, Zynio等^[5-6]认为其能改善灵敏度并不确切 ...

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... 显然,金银膜的灵敏度低于金膜,并不能提高灵敏度, Zynio等^[5-6]认为其能改善灵敏度并不确切 ...

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... Johansen等^[7]利用二象限光电探测器和采用二象限信号差和比的方法抑制系统噪声,获得高分辨率 ...

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... Tao等^[8]则认为检测器、 A/D转换器和找凹点算法(dip-finding algorithm)影响分辨率,且量化分析 ...

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... 1 2层金属膜的SPR传感模型棱镜耦合型SPR传感器在入射角为θ时,其反射率R可用3层结构的Fresnel复反射系数形式表示^[9] ...

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... 如果SPR检测系统的硬件和共振角的解算法已确定,那么系统的输出噪声为^[10] ...

... 角度法SPR检测系统的分辨率可表示为^[10] ...

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... 但是,在光强与相位法中,银膜比金膜的灵敏度高^[12],其理论基础是: ...

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... 半峰宽与介电常数虚部成正比关系,虚部越大,半峰宽越宽^[13] ...

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耿俊清, 余兴龙, 章恩耀, 等. 基于相位解算的SPR传感方法及其应用[J]. 仪器仪表学报, 2012, 33(10): 15-21.

GENG

Junqing

, YU

Xinglong

, ZHANG

Enyao

, et al. SPR biosensing method based on phase shift algorithm and its application[J]. Chinese Journal of Scientific Instrument, 2012, 33(10): 15-21. (in Chinese)

摘　要：提出了一种新颖的基于相位解算的表面等离子体谐振（surface plasmon resonance，SPR）传感方法，该方法包括一种基于振镜扫描的表面等离子体谐振实验装置和通过相位解算来确定谐振角的方法。装置采用振镜驱动入射光束进行角度扫描，避免扇形光束导致的干涉噪声；同时，选择振镜步进式角度扫描，实现完全同步采集数据，抑制采样时钟及扫描速度抖晃引起的相位噪声。相位解算确定谐振角法将衰减全反射（aaenuated total reflection，ATR）曲线转换到频域内处理，可有效克服光源噪声对传感测量的干扰，获得高分辨率。实验结果表明，该装置的折射率测量分辨率可达 1．8×10^-6，线性区间为1．33—1．38，能满足生物学测量的要求。磺胺甲恶唑（sulfamethoxazole，SMX）与其抗体（Anti—SMX）和MSI-78与固体支撑磷脂膜（solid．supposed lipid bilayer，SLB）之间反应的检测又进一步证明，该方法在生物医学中具有良好的应用前景。