一株高环多环芳烃降解嗜盐菌 Thalassospira sp.的分离及降解特性
王慧, 周海燕, 黄勇, 方婷婷
清华大学 环境学院,北京 100084

作者简介: 王慧(1969—), 女(汉), 辽宁, 教授。E-mail:wanghui@mail.tsinghua.edu.cn

摘要

为获得盐环境中高环多环芳烃(HMW-PAHs)污染修复的高效降解菌株,该文以芘为唯一碳源和能源,利用5%盐度矿物培养基(MSM)从石油污染土壤中富集分离出一株能降解菲、荧蒽、芘、苯并蒽的嗜盐菌,经形态学观察和16SrRNA序列鉴定为海旋菌( Thalassospira), 命名为 Thalassospira sp.strain TSL5-2。在5%盐度下, 25d内, TSL5-2对菲、芘、荧蒽(初始质量浓度均为20mg/L)、 苯并蒽(初始质量浓度为8mg/L)的降解率分别为100%、 53.3%、 60%、 18.1%,但不能降解苯并芘。TSL5-2耐盐范围为0.5%~19.5%,最适盐度为5%。外加酵母粉和蛋白胨(5mg/L)对菲的降解都有一定的促进作用,后者效果更为明显, 5d内菲的降解率分别为60.9%和82.1%,高于MSM对照组(46.1%)。酵母粉对TSL5-2降解芘和苯并芘的影响效果都不显著。蛋白胨对芘降解有抑制作用,但对苯并芘(5mg/L)降解有促进效果, 25d的芘和苯并芘的降解率分别为17.5%和38.2%。

关键词: ; 嗜盐菌分离; Thalassospira; 降解
中图分类号:X172 文献标志码:A 文章编号:1000-0054(2015)01-0087-06
Isolation and degradation characteristics of a HMW-PAHs degrading halophilic strain
Hui WANG, Haiyan ZHOU, Yong HUANG, Tingting FANG
School of Environment, Tsinghua University,Beijing 100084, China
Abstract

A halophilic cell strain was isolated that efficiently degrades high molecular weight-polycyclic aromatic hydrocarbon (HMW-PAHs) contamination in saline environments. This strain, which can degrade phenanthrene, fluoranthene, pyrene and benzanthracene, was isolated from oil-polluted soil with pyrene as the sole carbon and energy source in a mineral salt medium (MSM) of 5% salinity. The strain was identified as Thalassospira based on morphological observations and an 16SrRNA sequence and named Thalassospira sp. strain TSL5-2. After 25 days' cultivation in 5% salinity culture solution, strain TSL5-2 degraded phenanthrene by 100%, pyrene by 53.5%, fluoranthene by 60% (initial concentration: 20mg/L) and benzanthracene by 18.1% (initial concentration: 8mg/L), but could not degrade benzopyrene. TSL5-2 had a wide salinity tolerance range (0.5%-19.5%), with an optimal salinity of 5%. Adding yeast powder and peptone (5mg/L) to the MSM both improved the degradation of phenanthrene by TSL5-2, with degradation rates of 60.1% with yeast and 82.1% with peptone at day 5, both higher than the control group (46.1%). Yeast powder did not effectively improve the degradation of pyrene and benzopyrene. Peptone inhibited the degradation of pyrene, while accelerating benzopyrene degradation, with a pyrene degradation rate of 17.5% and a benzopyrene (5mg/L) degradation rate of 38.2% at 25 days.

Keyword: School of Environment; Tsinghua University; Beijing 100084; China

多环芳烃( polycyclic aromatic hydrocarbons, PAHs)是一类含有2个或2个以上苯环,以线性排列、弯接或簇聚等方式构成的有机化合物[1],其结构稳定、疏水性强、具有潜在致畸性、致癌性和遗传毒性,是近年来备受关注的一类持久性有机污染物。作为石油的重要成分,环境中的 PAHs主要来源于石油开采、运输、精炼以及各类石油化工生产过程。由于多数石油开采区都处于盐碱环境,石油化工往往产生大量高盐度废水。因此, PAHs污染常常伴随着盐环境[1]。生物降解被认为是去除环境中 PAHs的有效途径。高环多环芳烃( HMW-PAHs)的苯环个数达到或超过4个以上,其生物毒性明显升高,生物可降解性显著降低。盐环境下 HMW-PAHs的生物降解则更加困难[2,3]。目前,已分离到能够在盐环境中降解 HMW-PAHs的菌株还非常少,主要集中在Bacillus、 Halomonas、 Cycloclasticus、 Mycobacterium、 Pseudoalteromonas等菌属[1,2,3,4,5]。海旋菌(Thalassospira)因具有较大的耐盐范围和 PAHs的降解能力而日益受到重视[6,7,8]。但人们对其认识较晚,直到2002年 Lopez-Lopez[9]等才首次划分出该菌属。已有研究表明,石油烃污染环境或富集的 PAHs降解菌群中Thalassospira sp.是主要菌属之一[10,11],但分离获得的纯菌数量较少,且只能降解萘、芴等低环 PAHs, 有关海旋菌降解 HMW-PAHs的研究未见报道[8,10]

本研究以芘为唯一碳源和能源,在5 %盐度条件下,从长期受石油污染的土壤中分离出一株海旋菌(Thalassospira sp.), 并对海旋菌 PAHs降解特性进行研究,为 PAHs降解机理研究提供理论基础。

1 材料与方法
1.1 实验材料

菲、芘、荧蒽、苯并芘与苯并蒽购于美国Sigma-Aldrich公司(纯度大于99.5%); 聚合酶链反应(PCR)试剂、感受态细胞、 DNA纯化试剂盒等分子生物学试剂购自宝生物公司。丙酮、无水甲醇等化学试剂均购于国药(分析纯)。

所有降解实验均采用添加PAHs的矿物培养基(MSM), MSM组成为[12,13]: Na2SO4, 3.0g; NH4Cl, 0.3g; CaCl2·2H2O, 0.15g; KH2PO4, 2g; KCl, 0.5g; NaCl, 40.0g; MgCl·6H2O, 6.0g; 去离子水1000mL, 微量元素溶液, 1.0mL; 维生素溶液, 2mL; pH为7.3~7.5。

不同盐度MSM的配置: 按照NaCl∶MgCl2·6H2O为20∶3比例配制,其余成份不变。

1.2 实验方法

1.2.1 芘降解菌的分离鉴定

从胜利油田采集石油污染土壤,样品保存在-20℃备用。

称取5g石油污染土壤于100mL以芘(20mg/L, 丙酮作为助溶剂)为唯一碳源和能源,盐度为5%的MSM培养基中, 30℃、 170r/min培养箱驯化15d后,取10mL上清菌液于新鲜MSM中传代。5个传代周期后,采用稀释平板法将菌液涂布在表面涂有芘的琼脂平板上,挑取其中生长旺盛的单菌落多次平板划线分离,获得纯菌。提取菌株DNA[14], PCR扩增其16SrRNA基因后与载体连接,转入感受态细胞,挑取白斑再次PCR验证,并将产物送至北京市擎科生物科技公司完成16S rRNA测序。用BLAST软件在Genbank上对获得的16SrRNA序列进行同源性比对。利用MEGA软件和Neighbor-Joining法,以比对结果和参考菌株序列及其他菌属序列构建系统发育树。

1.2.2 菌悬液的配制

无菌条件下,从培养平板上挑取单菌落于盐度为5%的芘MSM培养基,在30℃、 170r/min培养6d, 5000r/min离心5min, 去除上清液,用适量新鲜MSM培养基重悬,再次离心、重悬,获得吸光度OD600(在600nm波长下)值约为0.25的菌悬液。本研究所有降解实验均以此菌悬液为初始接种物。

1.2.3 不同盐度下芘的降解实验

按照NaCl∶MgCl2·6H2O为20∶3比例配制盐度为0.5%、 1.5%、 3%、 5%、 10%、 19.5%的MSM培养基,灭菌后添加芘,使其初始质量浓度为20mg/L。分别接种1.0mL菌悬液至5mL上述芘/MSM培养基中,每个盐度设置3个平行实验,同时以接种灭活菌液为对照。在30℃、 170r/min条件下培养,分别在第0d、 2d、 3d、 5d、 8d、 11d、 15d、 20d、 25d取样,测定芘残余量以及菌株的OD600值。

1.2.4 不同PAHs的降解实验

取1.0mL菌悬液接种到5mL已灭菌的含有单一PAH(菲、荧蒽初始质量浓度均为20mg/L; 苯并芘、苯并蒽初始质量浓度为8mg/L)5%盐度MSM反应体系,设置3个平行实验,测定第0d、 15d、 25d每种PAHs的残余量。

1.2.5 不同营养添加物对PAHs降解的影响

构建分别含不同PAH(菲、芘的初始质量浓度均为20mg/L; 苯并芘的初始质量浓度为8mg/L)、 盐度为5%的MSM反应体系,方法同上。向反应体系添加酵母粉(yeast)、 蛋白胨(peptone)或同时添加两者(质量浓度各为5mg/L), 设置3个平行实验,分别在0d、 15d、 25d测定反应体系中PAHs残余量。培养基及蛋白胨均经过高温灭菌,酵母粉则经0.22μm滤膜过滤灭菌。

1.2.6 实验分析方法

1) OD测定: 利用分光光度计,测定600nm波长菌液吸光度。

2) PAHs测定: 向6mL反应体系中加入10mL二氯甲烷,振荡萃取后,全部转移至20mL棕色瓶,于500r/min离心2min, 5mL玻璃注射针吸取有机相经0.22μm滤头过滤至棕色进样瓶,在高效液相色谱(HPLC,岛津,日本)上测定。

3) 高效液相色谱HPLC测定条件: 参考文[15]的条件设置。

实验初始制作菲、芘、荧蒽、苯并芘和苯并蒽的质量浓度与峰面积的标准曲线。

2 结果与讨论
2.1 芘降解嗜盐菌分离鉴定

石油污染土壤中微生物经富集和多次平板划线,分离出一株以芘为唯一碳源和能源生长的菌株,菌落圆形,表面光滑,中间隆起,凸面,边缘光滑,呈现黄色。直径0.5mm~0.7mm, 菌株为杆状。经革兰氏染色镜检为革兰氏阴性菌。

16SrRNA序列比对结果表明,该菌与 Thalassospiraxianhensis P-4 (EU017546)、 Thalassospira xaiamenensis PTG4-18(EU603449)等多株 Thalassospira菌相似度为99%,确定该菌为 Thalassospira属。将该菌命名为 Thalassospira sp.strainTSL5-2 (简称TSL5-2)。从系统发育树(图1)可知,该菌与 Thalassospira lucentensis P44亲缘关系最近。

图1 基于TSL5-2的16SrRNA与参考菌株16SrRNA基因序列的系统发育树

2.2 TSL5-2的生长与芘的降解

将菌株TSL5-2接种到含20mg/L芘的MSM(盐度为5%)中,研究其对芘的降解和生长情况。结果表明,在最初3d内,菌株TSL5-2处于适应期,随后快速生长,第8d时, OD达到最大值(OD值为0.33), 此时芘降解率为14.2%,第11d开始,菌株加快了对芘的利用, 25d后芘的残余量为9.05mg/L, 降解率达53.3%(图2)。对照组菌株OD与芘残余量维持在初始值。有研究报道 Cycloclasticu strains[5]和Selenastrum capricornutum[16]在3%盐度下降解初始质量浓度为1.0mg/L的芘, 7d的降解率分别为45%和49.6%,平均降解速率为0.14mg/(L·d)。本实验结果表明TSL5-2的平均降解速率为0.44mg/(L· d), 与之相比, TSL5-2具有较好的降解高质量浓度高环PAHs的能力。

图2 TSL5-2对芘的降解及菌株生长情况

已有研究发现,盐度是影响降解菌降解PAHs的关键因素之一[17,18,19]。由图3可见, TSL5-2在0.5%~19.5%盐度下范围内对芘均有降解作用,但降解效果有一定差异。最适盐度为5%, 25d内芘的降解率达到53.3%; 在盐度为0.5%、 1.5%和3%条件下的菌株对芘的降解没有明显差别(约48.5%); 而9.5%和20%高盐度条件下菌株仍能降解芘,降解率分别为32.4%和29.6%。Minai[19]等的研究表明,石油污染土壤中微生物在1.0%盐度下对菲、蒽和芘的降解率最高,在0~1.0%盐度内,盐度不影响PAHs降解,超过最适盐度(1.0%), PAHs降解率随盐度的增加而降低。

图3 不同盐度条件下TSL5-2对芘的降解

2.3 菌株TSL5-2降解特征研究

除芘以外, TSL5-2还能降解菲、荧蒽和苯并蒽等多种PAHs, 如图4所示。7d内, 20mg/L的菲被完全降解,显示出菌株对低环多环芳烃有较强的降解能力。15d内荧蒽的降解率达到35.0%,延长至25d后增大至60%,与芘的降解率(53.3%)相近。TSL5-2对五环的苯并蒽降解能力较差, 25d内只能降解18.1%,几乎不利用苯并芘。本研究结果表明菌株TSL5-2对相同苯环数的PAHs降解能力相近,环数越高,越难被降解。有文献报道在3%盐度下, Cycloclasticus strains[5]能够7d内将5m/L的萘、菲完全降解,但对初始质量浓度1.0mg/L的芘只能降解45%; Selenastrum capricornutum[16]经过7d培养后,对初始质量浓度为1mg/L的荧蒽和芘的去除率分别为57.6%与49.6%。这与多环芳烃环数增加、疏水性增强、挥发性降低、化学性质趋于稳定、对生物毒性更大等因素有关[20]。已有研究表明HMW-PAHs在环境中的半衰期远大于低环PAHs[21],因此在HMW-PAHs污染修复时可通过适当延长修复周期来强化修复。

图4 TSL5-2对不同PAHs的降解能力

2.4 不同营养添加物对降解PAHS效果的影响

从上述研究结果可以看出,相对于低环多环芳烃(LWM-PAHs), HWM-PAHs生物毒性更高,生物可降解性更差,高盐度进一步降低HWM-PAHs的生物可降解性。有研究添加微量酵母粉和蛋白冻等营养物质可提高PAHs的生物可降解性,因此,本研究比较了向5%盐度的MSM中添加不同种类的营养物对TSL5-2降解不同种PAHs效果的影响,结果如图5所示。比较TSL5-2分别在不添加、分别添加酵母粉或蛋白胨、同时加入酵母粉与蛋白胨的MSM中对菲的降解(图5a)可知, 5d内菲(20mg/L)的降解率分别为46.1%、 60.9%、 82.1%和61.3%, 7d后菌液中的菲都被完全降解,表明添加酵母粉、蛋白胨能够加快菌株TSL5-2对菲的降解; 当降解底物为芘(20mg/L)时,添加酵母粉对降解效果影响不大,但添加蛋白胨则显著影响了芘的降解, 15d的降解率从32.6%降低到10.1%, 25d内的降解率仅17.5%,明显低于对照组的53.3%。表明添加酵母粉不能有效提高多环芳烃的降解率,加入蛋白胨则抑制菌株对芘的降解(图5b); 在MSM和添加酵母粉的MSM中TSL5-2几乎不能利用苯并芘,但添加蛋白胨或者同时添加蛋白胨和酵母粉后, 25d内菌株TSL5-2能将5mg/L的苯并芘分别降解38.2%和34.8%,表明酵母粉对菌株降解苯并芘的影响不显著,而蛋白胨则有促进作用(图5c)。

图5 添加酵母粉、蛋白胨或同时添加酵母粉与蛋白胨对降解菲、芘和苯并芘的影响

一般认为,添加微量酵母粉(质量比为0.01%~1.0%)或其他营养物能增加盐环境中PAHs降解,其原因可能是酵母粉提供了甜菜碱等相容性溶质,提高了PAHs的生物可利用性[22]; 也有人认为蛋白胨补充了氮源[23]。但本实验发现,营养物对PAHs降解的影响效果与添加的营养物和PAH种类有关。添加酵母粉和蛋白胨对降解低环PAHs菲都有一定促进效果,蛋白胨效果更为显著。对于难降解的高环PAH芘和苯并芘,酵母粉对两者影响都不显著,蛋白胨对前者有抑制作用,对后者则有促进作用。可能原因是研究中添加的营养物质量浓度不适宜。刘芳等[20]研究结果显示,向100mg/L的荧蒽溶液中加入400mg/L的蛋白胨,荧蒽的降解率达到最大值,蛋白胨加入量过高或过低都会抑制菌株对PAHs的降解。也可能与实验过程取样检测时间点有关,不同营养物对PAHs降解影响机理还需要进一步研究。

3 结论

本文采用以芘为唯一碳源和能源、 5%盐度矿物培养基,从胜利油田石油污染土壤中分离获得一株高环多环芳烃降解嗜盐菌,并探究其对PAHs的降解特性,主要结论如下:

1) 经过16SrRNA序列比对分析,判定该菌为 Thalassospira属。命名为 Thalassospira sp.strain TSL5-2。TSL5-2在25d内对芘(20mg/L)的降解率为53.3%,且在0.5%~19.5%盐度范围内对芘均有降解作用, 5%盐度下降解效果最好。

2) 在无机盐培养基中, TSL5-2能够降解菲、芘、荧蒽、苯并蒽,但不能利用苯并芘。7d内, 20mg/L的菲被完全降解。25d内芘和荧蒽的降解率分别为53.3%和60%,对五环的苯并蒽降解能率只有18.1%,几乎不利用苯并芘。

3) 营养物对菌株TSL5-2降解PAHs的影响效果与添加的营养物和PAH种类有关。添加酵母粉和蛋白胨(5mg/L)对低环PAH菲的降解都有一定的促进效果,后者效果更为明显, 5d内菲的降解率分别为60.9%和82.1%,高于MSM对照组(46.1%)。; 酵母粉对难降解的高环PAH芘和苯并芘的降解效果影响都不显著; 蛋白胨对芘降解有抑制作用,对苯并芘则有促进作用, 25d的芘降解率仅17.5%。MSM和添加酵母粉中TSL5-2几乎不能利用苯并芘,添加蛋白胨或者同时添加蛋白胨和酵母粉后, 25d内菌株TSL5-2能将5mg/L的苯并芘分别降解38.2%和34.8%。

本研究证实 Thalassospira sp.不但能以低环PAHs(如菲等)为唯一碳源和能源生长,还能降解高环PAHs, 是PAHs污染的盐环境中PAHs主要降解菌属之一。该研究结果为菌株强化生物修复应用奠定了基础。

The authors have declared that no competing interests exist.

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