2. 上海利格泰生物科技有限公司, 上海 201712
2. Shanghai Ligatech Bioscience Co., Ltd., Shanghai 201712, China
膝关节是人体中最大且最复杂的关节，膝关节交叉韧带对膝关节各类运动的稳定性具有重要作用[1]。交叉韧带损伤是人体膝关节中最常见的损伤之一[2]，全世界每年有超过200万例前交叉韧带损伤，其中大多数与体育运动有关[3]。由于膝关节交叉韧带的自我愈合能力较差且血供缺乏，损伤后通常需要手术重建[4-5]。重建材料按照来源分为自体移植物、同种异体移植物和人工韧带3种。然而，自体移植物会受到患者自体肌腱情况和数量的限制，还可能导致膝前痛、关节纤维化等并发症[6-7]。同时，异体移植物还存在免疫排斥反应、愈合延迟、供体来源受限、交叉感染，以及价格昂贵等问题[8]。相比之下，人工韧带具有无供区并发症、无免疫排斥反应、力学强度高和术后恢复快等一系列优势，因此成为现阶段的研究热点[9-10]。随着社会发展及人们对重返高水平活动能力需求的不断增加，选择人工韧带进行重建的患者数量日益增多[11]。
自20世纪70年代起，已有超过20种人工韧带应用于临床[12]，但均因过度磨损出现断裂问题而渐渐退出临床应用。文[13]分析了14种人工韧带移植失效的原因，结果显示，几乎每种韧带都存在纱线与纱线间、纱线与骨间的相互磨损，最终导致纤维表面磨损和脱落。临床与动物实验结果也进一步表明，人工韧带磨损产生的磨屑可能引发医源性关节病，如膝关节肿胀和滑膜炎等[6, 14]。尽管韧带先进增强系统(ligament advanced reinforcement system，LARS)在一定程度上改善了这一问题，但仍存在部分由于磨损断裂导致的重建失败和并发症等问题[7]。此外，人工韧带磨损后不仅会削弱假体[15]，而且会形成不溶性磨屑，最终导致骨关节炎并破坏软骨细胞完整性[16]。因此，探究人工韧带体外摩擦磨损性能显得尤为重要。
目前，国际标准化组织(International Organization for Standardization，ISO)与美国材料与试验协会(American Society of Testing Materials，ASTM)等国际标准组织尚未发布人工韧带摩擦磨损的相关标准。中国现有的YY/T 0965—2014《无源外科植入物人工韧带专用要求》[17]已发布近10年，虽然该标准提出了人工韧带的疲劳磨损试验方法，但仅对韧带的磨损强度做了定义，未明确如何测量韧带的磨损量。本研究在YY/T 0965—2014标准[17]的基础上，进行人工韧带体外摩擦磨损试验的构建。通过重量分析法与宏观和微观表面形貌分析评价人工韧带的磨损情况，并对磨损后产生的磨屑进行提取和表征。
1 试验材料与方法 1.1 试验样品与设备试验对象为左侧前交叉韧带，如图 1所示，韧带材料为聚对苯二甲酸乙二醇脂(polyethylene terephthalate，PET)。参考YY/T 1426.1—2016标准《外科植入物全膝关节假体的磨损第1部分：载荷控制的磨损试验机的载荷和位移参数及相关的试验环境条件》[18]，采用“3+1”试验配置，即3个磨损试验组(001号、002号和003号)和1个加载对照组(004号)。试验中使用生理盐水作为润滑介质。
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| 图 1 左侧前交叉韧带 |
磨损试验设备使用Orthotek实验室的动态拉伸试验机。选用电子天平(Sartorious，SECURA225D，德国)和体视显微镜(Leica Stereozoom S9i，德国)对试验后人工韧带的磨损情况进行评价，采用冷场发射扫描电子显微镜(scanning electron microscope，SEM，JSM-7500F，日本)采集磨屑形貌。
1.2 试验步骤步骤1 样品浸泡与称重。磨损试验前，将4组人工韧带置于生理盐水中，保证其充分浸没并浸泡4周。完成浸泡后，参照YY/T 1426.2—2016标准《外科植入物全膝关节假体的磨损第2部分：测量方法》[19]对韧带进行第一次清洗并称重，利用显微镜采集其表面微观形貌以提供磨损试验对比依据。
步骤2 样品磨损试验。交替拉力试验装置示意图如图 2a所示，将试验装置与水浴容器固定于动态拉伸试验机上并完成样品固定。试验组的人工韧带一侧固定于60°斜面上，另一侧通过三爪卡盘夹紧，使人工韧带紧贴辊子并处于绷紧状态，在拉伸轴上进行摩擦运动，如图 2b所示；而加载对照组的人工韧带仅承受轴向循环拉伸载荷。试验过程中在水浴容器里添加足量的生理盐水，以保证没过韧带与辊子的摩擦面。为模拟人体环境，采用恒温系统使溶液在试验过程中保持(37±2) ℃，并使用波纹管套在水浴容器上以防止水分蒸发以及外界灰尘进入溶液中。试验参数如表 1所示。
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| 图 2 试验样品安装图 |
| 参数 | 数值 |
| 温度/℃ | 25±5 |
| 相对湿度/% | 40±10 |
| 总循环次数 | 2×106 |
| 频率/Hz | 2 ±0.5 |
| 载荷/N | 49 ~441 |
| 辊子直径/mm | 10 |
| 摩擦面距离自由丝/mm | 15±1 |
| 上下夹具距离/mm | 100 |
| 辊子摩擦面粗糙度/μm | ＜0.5 |
步骤3 样品清洗称量。试验过程中，每0.5×106次磨损为一个周期，每个周期结束后需要停机一次更换润滑介质，直至达到2.0×106次。在第0、0.5×106、1.0×106和2.0×106次分别对样品进行清洗称量。
步骤4 磨屑提取。体外磨损试验结束后，选取1.5×106~2.0×106次循环使用的润滑介质进行磨屑提取与分析。磨屑提取步骤如下：采用孔径为0.2 μm的滤膜过滤生理盐水中的杂质；为保证取样具有代表性，使用玻璃棒均匀搅拌生理盐水5 min并量取10 ml生理盐水；通过0.05 μm聚碳酸酯滤膜真空抽滤，在滤膜上得到磨损后的磨屑。
1.3 试验评价方式 1.3.1 人工韧带磨损量使用电子天平对人工韧带称重，借助体视显微镜对人工韧带进行微观形貌表面的采集。目前缺乏人工韧带称重的相关标准，因此本次试验部分参照YY/T 1426.2—2016[19]中膝关节假体磨损的测量方法，即重量分析法，进行磨损量的测量。试验组测量因磨损产生质量损失，而加载对照组测量因吸水而产生增重，进行磨损量及磨损率计算，表示如下：
| $ W_n=W_{\mathrm{a} n}+S_n \text {. } $ | (1) |
其中：Wn为n个加载循环次数后试验样品的净质量损失；Wan为未修正的试验样品平均质量损失；Sn为对照样品n个加载循环次数后质量的平均增量。
使用最小二乘法线性拟合Wn与n之间的关系方程，确定平均磨损率aG，表示如下：
| $ W_n=a_G n+b \text {. } $ | (2) |
其中b为常数。
1.3.2 人工韧带磨屑分析将带有磨屑的滤膜进行裁剪，并粘贴在有碳胶带的铝块上，使用扫描电子显微镜观测磨屑的形貌特征。为使磨屑具有导电性，须先对滤膜进行喷金处理。在8 000倍放大倍数和5.0 kV加速电压下，随机获取磨屑的清晰图像。之后，利用Image-Pro Plus图像分析软件将磨屑从图像中分离，获取磨屑数量、最大直径dmax、最小直径dmin、周长P、长L、宽W、面积A。参照ASTM F1877-16(Standard practice for characterization of particles)[20]，利用以上数据计算等效圆直径DEC、纵横比RA、延伸率E、圆度R和形状因子Ff等参数，以描述磨屑尺寸和形状，表示如下：
| $ D_{\mathrm{EC}}=\left(4 \times \frac{A}{\pi}\right)^{\frac{1}{2}} ; $ | (3) |
| $ R_{\mathrm{A}}=\frac{d_{\text {max }}}{d_{\text {min }}} ; $ | (4) |
| $ E=\frac{L}{W} ; $ | (5) |
| $ R=\frac{4 A}{\pi d_{\text {max }}^2}, 0 \leqslant R \leqslant 1 ; $ | (6) |
| $ F_{\mathrm{f}}=\frac{4 \pi A}{P^2}, 0 \leqslant F_{\mathrm{f}} \leqslant 1 . $ | (7) |
经过2×106次体外磨损试验后，根据重量分析法计算人工韧带的磨损量，如表 2所示。对人工韧带的磨损量结果进行分析，如图 3所示。可以看出，试验组3个样品的磨损量均随循环次数增加而增加。根据式(2)对试验组样品的磨损量进行线性拟合，可得到样品001号、002号、003号的磨损率分别为4.30 mg/106次、8.51 mg/106次、8.01 mg/106次，人工韧带的平均磨损率为(6.94±2.30) mg/106次。
| mg | |||||||||||||||||||||||||||||
| 周期/106 | 试验组 | ||||||||||||||||||||||||||||
| 001号 | 002号 | 003号 | |||||||||||||||||||||||||||
| 0 | 0 | 0 | 0 | ||||||||||||||||||||||||||
| 0.5 | 3.90 | 2.48 | 4.76 | ||||||||||||||||||||||||||
| 1.0 | 8.78 | 10.24 | 6.08 | ||||||||||||||||||||||||||
| 2.0 | 10.90 | 15.94 | 16.24 | ||||||||||||||||||||||||||
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| 图 3 人工韧带磨损量结果 |
2.2 表面形貌
对试验后的001、002和003号样品进行宏观和微观表面形貌采集，观测人工韧带宏观表面发现，人工韧带与辊子摩擦面丝线断裂，人工韧带表面起毛，如图 4所示。通过体视显微镜对比人工韧带试验前后的微观形貌，试验前，人工韧带初始表面呈现完整编织状结构，丝线排列紧密，整齐有序，试验过程中由于人工韧带和辊子不断摩擦，部分丝线因出现疲劳性损伤而断裂，部分编织状结构受损，出现松散、抽丝等现象，对比结果如图 5所示。
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| 图 4 2×106次磨损试验后人工韧带表面形貌 |
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| 图 5 人工韧带试验前后表面显微形貌 |
2.3 磨屑分析
利用SEM获得人工韧带磨屑图像，如图 6所示，磨屑呈白色不透明状，主要为形状不规则的颗粒，轮廓复杂且表面粗糙，大小从纳米级别至微米级别。磨屑各参数结果如表 3所示。图 7为磨屑各个参数的相对频率分布图，由图可知，超过70%的磨屑的RA和E均为1.00~1.75，Ff为0.60~0.95，R为0.35~0.75，DEC≤0.20 μm。其中：RA与E均为表征磨屑形状是否为细长形的参数，值从1开始，值越大表示磨屑形状越偏细长，若RA＞2，则磨屑为纤维条状(包含条状、棒状及部分片块状颗粒)；若RA≤2，则磨屑为类球状[21]。R和Ff是衡量磨屑形状与圆相似程度的参数，越接近于1表示磨屑形状越偏向圆形。DEC为与磨屑投影面积相等的圆的直径，是衡量磨屑尺寸的重要参数。
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| 图 6 磨损试验后磨屑的SEM图像示例 |
| 类别 | RA | E | Ff | R | DEC/μm |
| 最小值 | 1.00 | 1.00 | 0.07 | 0.08 | 0.03 |
| 最大值 | 7.31 | 6.03 | 0.95 | 0.95 | 2.32 |
| 平均值 | 1.64 | 1.55 | 0.73 | 0.55 | 0.18 |
| 标准差 | 0.84 | 0.63 | 0.21 | 0.19 | 0.23 |
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| 图 7 磨屑各参数相对频率分布图 |
3 讨论
针对人工韧带磨损量测量方法不明确，缺少长期使用条件下磨损情况量化的问题，本研究根据YY/T 0965—2014标准[17]使用生理盐水模拟人体体液环境，参考膝关节韧带受力，对人工韧带进行2×106次磨损试验，通过周期性称量及数据拟合分析人工韧带的磨损情况，并进行表面形貌拍摄和磨屑分析。试验结果表明：3个试验组人工韧带的磨损量基本呈线性增长。该磨损率与文[22-24]分析得出的部分髋关节假体及膝关节假体磨损率相当，髋、膝关节假体磨损已得到了关注和研究[25-26]，人工韧带的磨损也不容忽视。此外，对磨损后的人工韧带进行宏观与微观观测，可以观察到人工韧带表面部分组织起毛且编织状结构受损，丝线排序松散、丝线出现断裂，这些情况与临床上翻修取出物失效形式一致(见图 8)。
针对体外磨损试验产生的磨屑问题，对试验中1.5×106~2.0×106次使用的润滑介质进行磨屑提取，进一步表征人工韧带的磨损情况。有效提取人工韧带磨屑，对统计的所有磨屑进行分类并分析磨屑的各个参数。结果表明：试验提取的磨屑大多数为类球状，少部分为纤维条状，且小尺寸磨屑较多，大尺寸磨屑较少。纤维条状磨屑相较于类球状磨屑，更易引发关节内的炎症反应[27]，因此使用PET材料人工韧带可能会减少磨屑在关节内引发滑膜刺激和炎症的风险。此外，研究表明，磨屑尺寸为0.3~10.0 μm时具有较高的生物活性[28]，而在本次提取的磨屑中，84.9%的磨屑等效圆直径小于0.3 μm，这些磨屑的生物活性相对较低，可刺激细胞产生的炎症因子较少，引发关节疾病的风险较低。
截至目前，尚未有文献对临床中取出或体外磨损试验中的人工韧带磨损量进行报道，仅有部分研究者对人工韧带材料的寿命进行了评价。以Gore-Tex人工韧带为例，疲劳测试结果显示其预计在4×109屈伸周期后发生完全断裂，韧带在3×108个周期内的伸长率小于4%[29]。若韧带植入后患者每年平均进行4.2×107次屈伸，则韧带预期可使用95 a，且在术后13.3 a移植物的伸长也不超过4%[12]。但临床随访结果显示，部分采用Gore-Tex人工韧带重建前交叉韧带的患者5 a内即出现较高断裂率，这表明人工韧带断裂失效的原因并非材料本身[30]。文[13]和[15]表明，磨损是影响人工韧带使用寿命的一个重要因素，因此建立科学合理的体外磨损测量方法及磨屑分析对于准确预估人工韧带的临床磨损情况具有科学价值与研究意义，且对于确保产品在临床前的安全性评估具有重要意义。
4 结论本文根据YY/T 0965—2014标准对人工韧带进行2×106次体外摩擦磨损试验，结合YY/T 1426—2016系列标准，通过重量分析法及观测人工韧带的宏观、微观形貌对韧带磨损情况进行评价，并对磨损产生的磨屑进行提取及表征。结果表明：本次磨损试验得出人工韧带磨损率为(6.94±2.30) mg/106次。人工韧带磨损后表面部分组织起毛且编织状结构受损，丝线排序松散且出现断裂，与临床中取出的失效韧带具有相似特征；人工韧带磨损后产生磨屑，本次试验提取的磨屑形状大部分为类球状，少部分为纤维条状，且小尺寸磨屑较多，大尺寸磨屑较少。
综上所述，人工韧带的生物摩擦学行为直接影响置换手术的效果，因此在临床应用前就需要对人工韧带的摩擦磨损性能进行研究。同时，磨损产生的磨屑含有大量摩擦学信息，人工韧带体外磨屑的分离提取及磨屑特征等的观测对监视韧带磨损状态，揭示韧带磨损规律具有重要意义。
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