白云岩砂化问题是滇中引水工程玉溪段面临的较为典型的特殊不良地质现象，该现象将直接或间接导致隧洞突水涌沙、墙体强度降低，易造成隧洞塌方、断裂等现象^[1-2]。玉溪段沿线的隧洞依次是小扑隧洞、老尖山隧洞、扯那苴隧洞、大塘子隧洞、螺峰山隧洞等，隧洞穿越震旦系灯影组和陡山沱组白云岩洞段；白云岩具有砂化特征，在复杂的区域构造背景下，即主要受普渡河断裂和小江区域性活动断裂的影响，岩体结构以碎裂散体结构和薄层碎裂结构为主。经过现场勘探，结合岩体质量指标和声波测试进行分析，从地质主要特征、质量指标、围岩等级等方面将白云岩砂化程度划分为轻微砂化、中等砂化、强烈砂化和剧烈砂化4个等级^[1]。工程上通常基于石灰、水泥或环氧树脂等无机或有机注浆材料固化不良地质段土体^[3]，这些加固方式存在污染问题。因此，一种环境友好的微生物诱导碳酸钙沉淀技术(microbial-induced carbonate precipitation，MICP)应运而生^[4-5]。通过微生物在新陈代谢过程中产生的脲酶催化水解尿素产生碳酸根离子(CO₃^2-)，再与游离的钙离子(Ca²⁺)结合生成碳酸钙沉淀，以达到胶结加固土体的目的^[6]。自20世纪以来，陆续有学者发现了一些微生物，如硫酸盐还原细菌、嗜盐古菌、产甲烷古菌、浮游自养微生物等，以及与微生物有关的一些有机分子或有机碎片都能沉淀白云石，进一步的模拟实验也发现了越来越多的微生物能够沉淀白云石。另外，地质时期白云岩的微生物成因不断被学者认同，陡山沱组的盖帽白云岩很可能与微生物作用有关^[7]，因此有望在将来通过不断尝试改变或改良菌种及实验条件有效再生白云岩。

具备尿素水解能力的微生物种类较多，有巴氏芽孢杆菌(Bacillus pasteurii)、幽门螺旋杆菌、苏云金杆菌等。考虑到菌种活性和实验成本等问题，目前MICP技术使用的菌株大部分为巴氏芽孢杆菌ATCC11859、巴氏芽孢八叠球菌(Sporosarcina pasteurii) LZ3^[8-10]等，然而这些细菌诱导形成的碳酸钙生成量较少，加固效果也有待改进。Gao等^[11]从荒漠风积砂中分离纯化出葡萄球菌，发现其具有较好的诱导碳酸钙生成的能力，现场应用于沙漠表面时取得了明显效果。南京工业大学生物制药与工程学院从盐湖附近的土壤中筛选出表皮葡萄球菌X-NM1，经过分离筛选处理后测定其矿化效果，发现该菌种在类似条件下，相对于传统菌种具有更强的诱导碳酸钙沉积能力，可达16.8 g/L^[12]。

国内外对影响MICP技术加固土体效果的因素进行了较为深入的研究，脲酶活性、菌液体积、胶结液浓度及体积、处理间隔时间、钙源、加固方式，以及土体本身的物理性质等因素均对土体加固效果有重要影响。Whiffin^[13]分析了当Ca²⁺、尿素处于高浓度条件下时，巴氏芽孢杆菌脲酶的活性大小，发现当胶结液的pH为9.25时最适于巴氏芽孢杆菌的生长。赵志峰等^[14]发现当胶结液浓度为1.25 mol/L时，巴氏芽孢杆菌诱导生成碳酸钙的能力最强；随着注浆轮数的增加，无侧限抗压强度也越高，经过8轮注浆后样品无侧限抗压强度超过4 MPa。Lai等^[15]发现当胶结液浓度大于1 mol/L时，对微生物诱导生成碳酸钙的过程具有凝缓效果。Rong等^[16]发现当胶结液浓度为2 mol/L时，砂岩的无侧限抗压强度最高可达6.1 MPa。林文彬等^[17]利用巴氏芽孢八叠球菌在不同单元尺寸进行了使用MICP技术加固沙漠风积砂的研究，发现最佳灌浆胶结液浓度为0.75 mol/L，此时最高单轴抗压强度可达30.02 MPa。Abo-EI-Enein等^[18]研究了不同钙源对微生物加固土体效果的影响，发现氯化钙诱导生成碳酸钙晶体的量比醋酸钙和硝酸钙更多，加固后的效果也更好。张永杰等^[19]利用巴氏芽孢杆菌结合氯化钙、氯化镁及乙酸钙等3种胶结剂以及4种固化次数对花岗岩进行加固处理，发现最佳工况为使用氯化钙固化14次样品，此时无侧限抗压强度达1 045 kPa。崔明娟等^[20]分析了3种不同颗粒粒径范围的砂土固化效果，发现一定范围内，颗粒尺寸越小、土颗粒越密，产生的碳酸钙晶体结构性越强、加固效果越好。

现有研究大多将微生物加固技术应用于解决标准砂、粉土、黏土或者混合土体的加固问题，但鲜有微生物改良工程中白云岩砂化问题效果的研究。表皮葡萄球菌X-NM1诱导生成碳酸钙的能力较强，且尚未被广泛应用，有较高的研究价值。本文以云南省滇中引水工程玉溪段剧烈砂化白云岩为研究对象，开展表皮葡萄球菌X-NM1注浆加固剧烈砂化白云岩实验，研究胶结液浓度、注浆轮数及初始相对密度对注浆加固砂化白云岩无侧限抗压强度的影响规律，探究表皮葡萄球菌X-NM1加固砂化白云岩的可行性。

1 材料与方法 1.1 剧烈砂化白云岩

实验所用剧烈砂化白云岩取自云南省滇中引水工程玉溪段施工现场，虽然岩体表面保持一定完整性，但无法承受外力，手捏即碎，剧烈砂化白云岩样品如图 1所示。将天然剧烈砂化白云岩碾碎、过筛后放入105 ℃电热恒温鼓风烘箱中烘干至恒重，再放入振筛机中进行筛分实验，得到的颗粒级配曲线如图 2所示。

剧烈砂化白云岩样品颗粒分布区间主要为0.075~0.100 mm，粒径大于0.075 mm的颗粒占比93.38%，不均匀系数C_u为2.11，曲率系数C_cur为0.95，级配不良。其他物理性质指标如表 1所示，采用X射线衍射对其进行化学成分检测，得到其化学成分如表 2所示。

1.2 微生物菌种培养

实验所用菌种为从盐湖附近土壤中筛选并纯化后的高效碳酸盐矿化菌株表皮葡萄球菌X-NM1，细菌的筛选与提取参考李湘等^[12]的研究完成。培养基采用的是LB(Luria-Bertani)液体培养基，每升液体培养基包含10 g蛋白胨、5 g酵母粉、10 g NaCl及1 000 mL水。取少量盐湖附近的土壤加入100 mL生理盐水，放入摇床中振荡10 min后静置2 h。取1 mL上层清液注入100 mL的LB液体培养基中，并在温度为37 ℃、振荡频率为160 r/min的摇床中培养24 h。取1 mL菌液用无菌水按10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6的梯度依次稀释，选择10^-5、10^-6梯度的稀释菌液分别涂布于无菌平板上，于37 ℃条件下培养至有单菌落长出后，分离单菌落并接种于尿素液体分离培养基中，尿素液体分离培养基是包含5.000 g NaCl、2.000 g KH₂PO₄、1.000 g葡萄糖、0.012 g酚红、0.200 g蛋白胨、950 mL蒸馏水、50 mL单位体积质量为20 g/L葡萄糖和单位体积质量为24 g/L尿素的混合溶液。挑取尿素琼脂分离培养基上清晰呈红色的单菌落利用平板划线法在无菌平板上划线。重复上述步骤多次，直至平板上的菌落形态稳定，如图 3所示。将平板上的菌落用LB液体培养基培养，放入温度为37 ℃、振荡频率为160 r/min的摇床中振荡12 h，此时菌液在600 nm波长下的吸光值OD₆₀₀约为0.7，可用甘油储存至-20 ℃冰箱中备用。微生物培养流程示意图如图 4所示。

将储存的菌液取出活化后，以1∶500的比例接种到LB培养基中，放入温度为37 ℃、振荡频率为180 r/min的摇床中培养12 h，利用紫外分光光度计测试其OD₆₀₀，当该值约为1.5时取出使用。

1.3 胶结液的制备

胶结液为微生物加固实验提供氮源与钙源，实验所用的胶结液采用摩尔比为1∶1的尿素与氯化钙混合溶液。将1 mol/L无水氯化钙与1 mol/L尿素分别用少量无菌去离子水溶解，搅拌均匀后冷却至室温，再混合倒入容量瓶中，最后加入无菌去离子水定容至1 000 mL。实验中胶结液浓度选取0.25、0.50、0.75、1.00、1.50、2.00、2.50 mol/L 7种浓度。

1.4 实验装置

实验采用内径为40 mm、高为120 mm的亚克力两瓣膜作为注浆模具。首先，采用分层击实法制样，将剧烈砂化白云岩填充至乳胶膜内，将颗粒填充至约100 mm高度；其次，样品上下表面分别用土工布及透水纸作为过滤片，以减少注浆过程中液体对样品颗粒的冲刷；最后，用橡胶塞塞紧，用型号为BT100-2J的蠕动泵注浆。实验装置图如图 5所示。

注浆采用两阶段注浆法，第1步灌注2倍孔隙体积菌液，蠕动泵的注浆速度为1.5 mL/min，注入后静置12 h，使细菌在样品内扩散并吸附于白云岩样品表面；第2步注入同样为2倍孔隙体积的胶结液，注浆速度为1.5 mL/min，注入后静置12 h，确保菌液与胶结液充分反应生成碳酸钙结晶。

设定实验的每一轮次包含以下步骤：

1) 注入2倍孔隙体积菌液，静置12 h；

2) 注入2倍孔隙体积的胶结液，静置12 h，并重复3次。

完成上述即为完成1轮注浆，共设置3个不同实验轮次，实验温度控制为30 ℃，实验方案如表 3所示。

1.5 微生物注浆加固剧烈砂化白云岩效果测定 1.5.1 干密度

注浆完成后，将样品从模具中拆出并放入105 ℃烘箱中烘干至恒重，之后将柱体两端磨平，消除偏应力的影响。再测出其高度和直径，通过打磨使其长径比为2∶1，最后用电子天平称重，根据质量与体积的比值计算其干密度。

1.5.2 无侧限抗压强度

将样品放置于电子万能试验机的下加压板上，将加载速率调至1 mm/min，轴向应变达15%时停止加载，取峰值强度作为无侧限抗压强度值。实验结束后，收集保存样品，用于测定碳酸钙含量。

1.5.3 碳酸钙含量测定

对于传统的标准砂而言，微生物诱导生成碳酸钙技术中大多采用滴定法、热重分析法、酸洗法、称量法和电感耦合等离子体原子发射光谱法(inductively coupled plasma, ICP)等测试碳酸钙含量^[21-22]。由于实验所用天然剧烈砂化白云岩中碳酸钙含量近乎为0，因此采用酸洗法测试碳酸钙含量。将经过无侧限抗压强度实验后的样品烘干称重，再放入烧杯中，向其中加入过量0.1 mol/L的稀盐酸，搅拌至无气泡产生。过滤后用超纯水漂洗剩余残渣以清除表面的可溶性杂质，然后取出残渣放入105 ℃烘箱中烘干至恒重。2次称重的差值即为碳酸钙的质量。样品的碳酸钙含量w为样品烘干前后的质量差ΔM与烘干前质量M_i的比值，即

$ w=\frac{\Delta M}{M_{\mathrm{i}}} \times 100 \%. $

(1)

2 实验结果与分析 2.1 无侧限抗压强度

无侧限抗压强度是描述MICP加固土体力学性质最常用的力学指标，能够直接用于判定微生物加固技术的效果。当胶结液浓度为0时，即在进行实验时注入同等体积纯水，此时不发生化学反应，样品无法脱模成型，其无侧限抗压强度值近似为0，胶结液浓度为0.25 mol/L及以上的样品均可加固成柱体，加固后的样品如图 6所示。实验结束得到所有样品的无侧限抗压强度值如表 4所示。

2.1.1 注浆轮次与无侧限抗压强度的关系

根据表 4绘制D_r为0.3时，注浆轮次与样品的无侧限抗压强度值的关系如图 7所示。

由图 7可知，当D_r为0.3时，注浆后样品1轮、2轮和3轮的无侧限抗压强度值最高分别可达1.66、3.32和6.28 MPa。相较于注浆1轮后样品的最大无侧限抗压强度值，注浆3轮后样品的最高强度提升了近4倍。这是由于注浆轮次越多，微生物诱导生成的碳酸钙越多，对剧烈砂化白云岩颗粒的胶结力更强，孔隙填充率更高。

值得注意的是，当胶结液浓度较低时，实测的无侧限抗压强度并未完全符合随注浆轮次的增加而增加的规律。这是由于当胶结液浓度较低时，两端的细菌会先接触到Ca²⁺，将其吸收矿化后，中间的细菌难以再接触到Ca²⁺与其反应，碳酸钙晶体在样品顶部沉积，造成如图 8所示的两端强度高、中间强度低的情况，将导致样品不成形或样品强度随机。若当样品无侧限抗压强度取3次平行式样强度的平均值，胶结液浓度为0.75 mol/L时，微生物诱导生成的碳酸钙胶结效果有限，平行样品中出现个别样品强度极低的情况，导致取值时出现强度降低的现象。

2.1.2 不同的初始相对密度对样品强度的影响

当注浆轮次保持一定时，样品的无侧限抗压强度与D_r的关系如图 9所示。由图可知，D_r越高，样品的无侧限抗压强度越大，当D_r为0.7时，样品的无侧限压强度达到最大值7.69 MPa。主要原因是白云岩颗粒之间越紧密，能为微生物提供的位点越多，越有利于微生物固定及后续反应。

2.1.3 胶结液浓度与无侧限抗压强度的关系

胶结液浓度是影响无侧限抗压强度值的重要因素之一，微生物的生长情况易受胶结液浓度的影响。图 10绘制了当注浆轮次为3轮，D_r为0.7时，样品的无侧限抗压强度与胶结液浓度的关系。

随着胶结液浓度的增加，样品的无侧限抗压强度呈现先增大后减小的趋势，当胶结液浓度为0.25 mol/L时，样品的无侧限抗压强度值仅为0.13 MPa；当胶结液浓度为2.00 mol/L时，样品的无侧限抗压强度出现峰值，达7.69 MPa，无侧限抗压强度提高了58.1倍；而当胶结液浓度增加至2.50 mol/L时，样品的无侧限抗压强度反而大幅度降低至1.35 MPa。出现这一现象的主要原因是浓度较低的胶结液中溶质离子浓度含量较少，固化反应速率较慢，溶液中的Ca²⁺大多被吸附于样品两端与细菌反应，碳酸钙晶体分布不均匀，导致样品两端同中间的强度差异大，致使整体抗压强度相对较低；随着胶结液浓度的不断升高，细菌与胶结液中溶质离子的反应速率不断增大，在一定时间内，两者充分反应，生成的碳酸钙晶体均匀分布于样品的各个部位，大幅提高了样品的抗压强度；然而，尽管胶结液浓度高可以提高固化反应速率，但由于其中存在过量阳离子，会对微生物的生理活动及酶的活性起抑制作用，致使反应不充分且生成的碳酸钙含量明显减少，导致样品的无侧限抗压强度值大幅度降低。对样品的无侧限抗压强度随胶结液浓度变化的曲线进行拟合，拟合优度R²为0.97，可通过此函数预测样品在同等条件下，无侧限抗压强度随胶结液浓度的变化规律，函数关系式为

$ \begin{array}{*{20}{c}} y=14.01 x_{1}^{4}-22.88 x_{1}^{3}+17.13 x_{1}^{2}- \\ 3.99 x_{1}-2.40. \end{array} $

(2)

其中：y为无侧限抗压强度，x₁为胶结液浓度。

图 11为不同胶结液浓度下，D_r均为0.7的样品在3轮注浆后剧烈砂化白云岩样品的单轴抗压应力应变曲线。随着荷载的增加，样品的应变前期变化较小，此时样品外表出现细小裂缝，但对整体强度没有明显影响。当荷载值加大至样品的极限承载力时，样品出现脆性断裂，所受应力大幅降低，可观察到受压样品外观具有明显裂缝；并且此时荷样品承受的轴向应力与相应的轴向应变值即为在不同浓度下3轮注浆后砂化白云岩的单轴抗压应力应变值。当应力出现峰值后，样品仍可承受一定强度的荷载，这一强度的延续是加固材料必要的安全冗余。

2.2 碳酸钙生成量 2.2.1 注浆轮次与碳酸钙含量的关系

当D_r为0.7时，样品经过3轮注浆后，碳酸钙含量如图 12所示。样品的碳酸钙含量最高达29.62%。随着注浆次数的增加，游离的Ca²⁺随之增多，细菌产生的脲酶水解的尿素也增多，因此形成的碳酸钙晶体增多。

2.2.2 初始相对密度与碳酸钙含量的关系

碳酸钙含量是用于判定MICP技术有效程度的重要指标。由图 13可知，样品碳酸钙含量随着D_r的增加而增加，剧烈砂化白云岩颗粒密度越大，样品内部孔隙的孔径越小，能保留住的菌液与胶结液越多，因此产生的碳酸钙晶体越多。注浆3轮后，各胶结液浓度样品的碳酸钙含量平均值为10.49%~26.43%，当胶结液浓度为2.00 mol/L时，碳酸钙含量达到峰值。

2.2.3 碳酸钙含量与无侧限抗压强度的关系

样品碳酸钙的含量是决定无侧限抗压强度值的关键因素。图 14展示了63种不同工况下剧烈砂化白云岩加固后的碳酸钙含量与无侧限抗压强度的关系，并将所有数据拟合成指数函数，拟合公式为

$ y=0.35 \mathrm{e}^{0.1 x_{2}}-0.20. $

(3)

其中x₂为碳酸钙含量。

碳酸钙含量低的同时通常伴随着分布不均的情况，直到碳酸钙含量达到一定值时，样品的强度才会大幅度提升。由图 14可知，随着样品碳酸钙含量的不断增加，无侧限抗压强度明显提高。

2.3 加固后样品的干密度 2.3.1 注浆轮次与干密度大小的关系

当土样中碳酸钙生成量达到一定程度时，土样的强度才会明显提高，此时样品的干密度也会大幅度提高。如图 15所示，当胶结液浓度大于0.50 mol/L时，干密度在注浆2轮至注浆3轮时出现大幅度提升，增长率最高可达34.30%，注浆轮次对于微生物加固砂化白云岩的影响十分明显。

2.3.2 初始相对密度与干密度的关系

绘制样品D_r与干密度的关系如图 16所示，D_r与干密度呈正相关。但在数值方面，样品的D_r对干密度的影响较小，仅在浓度为1.50和2.00 mol/L的情况下增长率较大，最大可达15.27%；而胶结液浓度低于1.00 mol/L时，随着初始相对密度的增加，样品干密度的增长率均小于5.00%。

2.3.3 胶结液浓度与干密度的关系

当D_r为0.7，注浆轮次为3轮时，样品的胶结液浓度与干密度的关系如图 17所示。加固后样品干密度与无侧限抗压强度、碳酸钙含量变化趋势一致，随着胶结液浓度的增大先增加后减小。当D_r为0.7，胶结液浓度为2.00 mol/L时，样品的干密度出现峰值，达2.253 g/cm³；相较于D_r为0.7，胶结液浓度为0.25 mol/L时，样品的干密度增长了38.30%。

样品的无侧限抗压强度、干密度以及碳酸钙含量均在胶结液浓度为2.00 mol/L，D_r为0.7，注浆轮次为3时达到峰值，此即为这3种影响表皮葡萄球菌X-NM1注浆加固砂化白云岩参数的最优值。

2.4 样品微观结构

分别取加固前后的样品进行扫描电镜(scanning electron microscope, SEM) 拍摄，SEM结果如图 18—19所示，加固前白云岩晶体表面光滑，存在明显孔隙，经MICP注浆后，剧烈砂化白云岩颗粒表面、颗粒之间交接处形成了直径较小、排列紧密且具有一定厚度的凝胶状物质，将剧烈砂化白云岩颗粒胶结为一个整体，从而提高了砂柱整体的强度。

微生物诱导生成碳酸钙是一个动态过程，碳酸钙的形成同时起到了填充孔隙和胶结白云岩颗粒的作用，与此同时，前期碳酸钙晶体的形成也为后续的游离微生物提供了更多附着位点，进一步增大了有效碳酸钙晶体的沉积比例，使加固后样品的无侧限抗压强度明显增大。

3 结论

本文从单元尺度开展了不同灌浆轮次、胶结液浓度及D_r条件下MICP加固剧烈砂化白云岩的实验研究，得到如下结论：

1) 加固后样品的碳酸钙含量、干密度以及无侧限抗压强度值均随着注浆轮次和D_r的增加而提高；注浆轮次为3轮时，加固后的砂化白云岩柱体的碳酸钙含量为29.62%，强度可达7.69 MPa。随着胶结液浓度的增加，砂化白云岩柱体各项物理力学指标呈现先增大后减少的趋势，最优的胶结液浓度为2.00 mol/L。

2) SEM结果显示碳酸钙晶体有效填充了白云岩颗粒表面孔隙，胶结了白云岩颗粒，在加固过程中对于整体强度的增大起至关重要的作用。

3) 采用表皮葡萄球菌X-NM1对剧烈砂化白云岩进行注浆加固处理，能够在短期内将松散的白云岩颗粒固化为具有较高强度的柱体，有效增强其整体强度，达到改善白云岩砂化现象的效果。