2. 清华大学 生物医学测试中心, 北京 100084;
3. 清华大学 蛋白质研究技术中心, 北京 100084
2. Center of Biomedical Analysis, Tsinghua University, Beijing 100084, China;
3. Technology Center for Protein Sciences, Tsinghua University, Beijing 100084, China
激光扫描共聚焦显微镜(laser scanning confocal microscopy，LSCM)是20世纪80年代中期发展起来的细胞生物医学分析仪器[1-2]，它在荧光显微镜成像基础上加装了激光扫描装置，利用计算机进行图像处理，使用紫外光或可见光激发荧光探针，得到细胞或组织内部微细结构的荧光图像，是分子细胞生物学研究领域中的新工具。激光扫描共聚焦显微镜可以对样品进行断层扫描和成像，进行无损伤观察和分析细胞的三维空间结构[3-4]；可以同时定位不同的组分，对细胞内的物质和信号定量分析；可以借助高强度激光淬灭某一区域的荧光分子，计算周围非淬灭分子向受照区域扩散的速率等[5]。
目前，激光扫描共聚焦显微技术已广泛用于细胞形态观察、立体结构重组、动态变化过程等研究，并提供定性图像分析、定量荧光测定等实用研究手段，结合其他相关生物技术，在形态学、生理学、免疫学、遗传学等分子细胞生物学领域得到广泛应用[6-9]；除此之外，由于激光扫描共聚焦显微镜的特殊性能，其在工业检测领域[10-11]也有着不可替代的应用。
叶绿体是植物细胞和真核藻类执行光合作用的重要细胞器，除了进行光合作用外，还参与氨基酸、脂肪酸、植物生长物质、核苷酸、维生素以及次生代谢产物的合成[12]。叶绿体具有自发荧光和吸收荧光染料发出次生荧光的性能，因此在相关研究中通常采用激光扫描共聚焦显微镜观察叶绿体的荧光信号，但采用激光扫描共聚焦显微镜光谱扫描(λ扫描)功能系统观察叶绿体荧光光谱的研究较少。本文利用激光扫描共聚焦显微镜的λ扫描功能检测叶绿体的荧光光谱，获取不同激发波长对应的荧光发射谱，准确获得其荧光图像，不仅对叶绿体研究提供理论和实验依据，同时还对植物组织成像研究提供重要帮助。
1 材料与方法 1.1 实验材料本生烟(Nicotiana benthamiana)，由清华大学植物培养平台种植，培养条件为28 ℃、16 h光照/22 ℃、8 h黑暗，光通量密度20 klm/m2，湿度约60%，色温6 500 K。
1.2 实验样品制作取新鲜烟草叶片组织置于载玻片上，滴上蒸馏水做成临时封片，立即在激光扫描共聚焦显微镜下观察烟草叶片组织的上表皮并拍照。
1.3 实验仪器所用显微镜为Zeiss LSM780正置激光扫描共聚焦显微镜，共聚焦系统由Zen black软件控制；用于图像采集的显微镜物镜为Plan-Apochromat 20×物镜，数值孔径为0.8；显微镜配有电动载物台，最大行程130 mm×85 mm；激光器包括405 nm半导体激光器(30 mW)、458/488/514 nm氩离子激光器(35 mW)，561 nm固体激光器(20 mW)，594 nm氦氖激光器(2 mW)，633 nm氦氖激光器(5 mW)；共聚焦显微镜配有32通道GaAsP检测器用于光谱检测。
1.4 叶绿体自发荧光光谱扫描及数据分析烟草叶片制片后置于Zeiss LSM780正置激光扫描共聚焦显微镜的载物台上，调焦选择叶绿体自发荧光最亮的扫描层面。λ扫描分析采用405、458、488、514、561、594、633 nm波长激发光激发样品和32通道的GaAsP检测器成像。发射光接收范围均设定为411~695 nm，针孔大小(pinhole)为1 AiryUnit。扫描分辨率(frame size)为1 024×1 024；扫描速度(speed)为3.15 μs/pixel；扫描平均次数(averaging number)为2；色阶(bit depth)为12；放大倍数(zoom)为1.0，接收的带宽(band width)为8.9 nm。每根激发光采集3幅烟草叶片的荧光光谱，采用Zeiss Zen软件分析选定区域的荧光光谱，获取其相应发射光谱峰值。
1.5 叶绿体自发荧光图像获取基于激光扫描共聚焦显微镜λ扫描分析的结果，将叶绿体自发成像的发射光收集范围设定在637~758 nm。不同激发光在物镜末端激发光功率统一设定为0.05 mW，物镜末端的激光功率采用Gigahertz-optik PT9610光度计测量。共聚焦成像采用Ch2检测通道的PMT检测器接收，检测器电压(gain)设为600，手动调节Z轴位置至清晰的焦平面，扫描获取二维平面图像。条件同节1.4，每根激发光重复采集10幅烟草叶片的荧光图像，采用Zen软件分析某50个区域的平均荧光强度。其具体激光功率设定如表 1所示。
| 参数 | 参数值 | ||||||
| 激光波长/nm | 405 | 458 | 488 | 514 | 561 | 594 | 633 |
| 激发光二向色镜(MBS) | 405 | 458 | 488 | 458/514 | 458/561 | 488/594 | 488/561/633 |
| 物镜出口激光功率/mW | 0.05 | 0.05 | 0.05 | 0.05 | 0.05 | 0.05 | 0.05 |
| 软件设定功率/% | 2 | 19 | 3 | 5.2 | 1.4 | 14 | 8 |
1.6 叶绿体抗漂白自发荧光图像获取
利用激光扫描共聚焦显微镜高强度激光照射样品某一特定区域使荧光分子淬灭的特性，来检测烟草叶绿体自发荧光的稳定性。采用20×物镜端激光功率为0.05 mW的488 nm激光获取图像，使用100% 488 nm激光对样品连续重复漂白30次(320 s)，边漂白边获取图像，重复采集3次，采用Zen软件分析特定区域的平均荧光强度。
2 结果与分析 2.1 烟草叶片叶绿体自发荧光的荧光光谱分别采用405、458、488、514、561、594、633 nm波长激光对烟草叶片组织进行λ扫描，采用Zen软件分析荧光光谱。如图 1所示，不同激发波长下叶绿体自发荧光发射光谱集中在大于637 nm的波段，峰值均在681 nm处。
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| 图 1 不同波长激光下烟草叶片叶绿体自发荧光的荧光光谱 |
2.2 烟草叶片叶绿体自发荧光图像
用20×物镜端激光功率为0.05 mw的405、458、488、514、561、594、633 nm波长激光分别激发烟草叶片组织，荧光接收波长范围为637~758 nm，可以得到清晰的共聚焦烟草叶片叶绿体自发荧光图像(见图 2)。图像的明暗程度反应了激发光对叶绿体自发荧光的激发效率，图像亮度越高说明激发光对叶绿体自发荧光的激发效率越高。采用Zen软件对图 2中的图像进行处理，得到叶绿体自发荧光的平均荧光强度(见图 3)。可以看出，在高亮度图像中(激光波长分别为405、458、488、633 nm)，488 nm激光的激发效率最高，而在低亮度图像中(激发光波长分别为514、561、594 nm)，561 nm激发光的激发效率最低。
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| 图 2 烟草叶片叶绿体自发荧光图像，激光功率0.05 mW，接收波长637~758 nm |
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| 图 3 不同激光波长下烟草叶片叶绿体自发荧光的平均荧光强度 |
2.3 激光扫描共聚焦显微镜漂白功能检测烟草叶片叶绿体自发荧光稳定性
用20×物镜端激光功率为0.05 mW的488 nm激光采集叶绿体自发荧光图像，100% 488 nm功率激发光重复漂白样品30次(320 s)，得到烟草叶片叶绿体自发荧光淬灭情况(见图 4)。在30次重复漂白实验中，叶绿体的自发荧光强度几乎没有变化，这表明叶绿体自发荧光非常稳定，不容易被漂白。
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| 图 4 烟草叶片叶绿体自发荧光强度变化 |
3 讨论
荧光光谱法是研究生物样本性质和功能的一个重要方法[13-14]。随着生命学科的发展，获取样本荧光光谱、准确采集样本的荧光图像在生物学研究中越来越重要。激光扫描共聚焦显微镜利用激光作为光源，采用共轭聚焦原理和装置，避免了衍射光和散射光的干扰，可获得高清晰度的荧光光谱图像[15-17]。
叶绿体作为执行光合作用的重要细胞器，是细胞生物学等学科的重要研究对象，也是实验室常用的观察对象[18]。如刘向东[19]研究了在双光子激光(800 nm)连续扫描30s条件下观察拟南芥叶片叶绿体的运动轨迹；崔永兰等[20]在研究拟南芥基因编码蛋白的叶绿体定位工作中，采用488 nm激光激发样品，同时检测绿色荧光蛋白发射光与叶绿体自发荧光等，但均没有系统研究叶绿体自发荧光的激发效率和发射光谱。
本生烟具有生长速度快、生命周期短的优点，其叶片结构清楚，制成切片容易，很适合显微镜观察。本研究通过激光扫描共聚焦显微镜λ扫描检测叶绿体的自发荧光光谱，系统地研究了叶绿体自发荧光的激发效率和发射光谱，为有关叶绿体的荧光光谱研究提供理论和实据，具有一定的科学价值和社会经济效益。
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